全反式維甲酸與蛋白酶體抑制劑聯(lián)合誘導急性髓性白血病細胞分化和凋亡作用及分子機制研究.pdf

1、背景:誘導分化治療是腫瘤化學治療的一個重要領域,它利用分化誘導劑誘導腫瘤細胞分化成為正?；蚪咏５募毎?從而逆轉其增殖、浸潤、轉移等惡性表型來達到治療腫瘤的目的。維甲酸類化合物是被研究和臨床應用最為廣泛的分化誘導劑,其中全反式維甲酸(all-trans retinoid acid, ATRA)是第一個成功應用于白血病治療的誘導分化藥物,能夠特異性誘導急性早幼粒細胞性白血病(acute promyelocytic leukemia, A

2、PL)細胞分化成熟,完全緩解率高達90％,而且不誘發(fā)彌漫性血管內出血(disseminated intravascular coagulation, DIC),不引起骨髓抑制。ATRA的作用特點有別于傳統(tǒng)的細胞毒類抗腫瘤藥物,其作用機理的研究一直受到國內外專家的廣泛關注,并取得了重要成就。但是目前仍未有系統(tǒng)的理論解釋ATRA誘導細胞分化的分子機制,這也很大程度地限制了ATRA在臨床的廣泛應用。因此進一步研究維甲酸類藥物誘導細胞分化的分子

3、機制,具有重要的理論意義和應用前景,是目前細胞分子生物學領域的熱點之一泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)是細胞內大部分蛋白質選擇性降解的重要途徑,因此泛素-蛋白酶體通路廣泛參與如細胞周期調控、細胞凋亡、DNA修復、細胞信號轉導、蛋白的跨膜定位和細胞表面膜受體的內化等多種生理過程,對細胞的增殖及惡變有重要影響。近年來,泛素-蛋白酶體通路與細胞分化之間的相關性正受到國內外專家學者日益廣泛

4、的關注。泛素-蛋白酶體通路在晶狀體上皮細胞、神經(jīng)元細胞和少突神經(jīng)膠質細胞等的分化過程中發(fā)揮了重要的作用,但具體的作用機制又各有不同。2000年我國科學家研究發(fā)現(xiàn),泛素-蛋白酶體通路相關的基因在ATRA處理的APL細胞內表達明顯增加。此外,介導ATRA信號轉導的維甲酸受體RARa及其融合蛋白PML-RARa在ATRA作用過程中均由于泛素-蛋白酶體通路的降解而減少。由此可見,泛素-蛋白酶體通路在ATRA誘導白血病細胞分化過程中具有重要而復雜

5、的作用。但是,泛素-蛋白酶體通路與ATRA誘導白血病細胞分化的相關性研究至今未見報道。因此,本研究將系統(tǒng)探討泛素-蛋白酶體通路在ATRA誘導白血病細胞分化中的作用,研究蛋白酶體抑制劑對ATRA誘導白血病細胞分化的影響。具體研究內容分為三個部分:
　　1)闡明ATRA誘導白血病細胞分化過程中,泛素-蛋白酶體通路活性變化,進而分析抑制蛋白酶體活性對ATRA誘導細胞分化的影響。
　　2)采用多種蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合作用,從

6、細胞水平和整體動物水平系統(tǒng)評價兩藥聯(lián)合作用對白血病細胞分化的影響,并探討可能的分子作用機制。
　　3)在細胞水平研究ATRA與蛋白酶體抑制劑聯(lián)合作用誘導白血病細胞凋亡的作用及機制,以期為兩藥在臨床上合理應用提供理論依據(jù)。
　　第一章全反式維甲酸對人急性髓性白血病細胞泛素-蛋白酶體通路活性的影響
　　目的:ATRA作為腫瘤誘導分化治療的成功范例,其復雜的作用機制一直是細胞分化領域的研究熱點之一。本課題通過研究ATRA誘導

7、白血病細胞分化過程中泛素-蛋白酶體通路活性變化,進而分析抑制蛋白酶體活性對ATRA誘導細胞分化的影響,力求系統(tǒng)闡明泛素-蛋白酶體通路在ATRA誘導白血病細胞分化過程中的重要作用。
　　方法與結果:ATRA作用后,人急性髓性白血病細胞HL60和NB4細胞內泛素化蛋白表達水平均呈時間依賴性的變化趨勢。采用特異性蛋白酶體底物Suc-LLVY-AMC檢測ATRA作用后細胞內蛋白酶體水解活性變化,結果表明ATRA能夠明顯增強蛋白酶體的水解活

8、性,且呈時間依賴性關系,說明細胞內泛素化蛋白水平的增加是ATRA作用的直接結果,而非蛋白酶體活性降低導致的。熒光定量PCR結果表明,ATRA作用后泛素mRNA水平也呈時間依賴性遞增趨勢,其原因可能是為了滿足靶蛋白的泛素化標記需求。上述泛素-蛋白酶體通路各組成成分的活性變化與ATRA誘導的細胞分化進程具有高度的一致性,提示泛素-蛋白酶體通路可能參與調節(jié)ATRA誘導的白血病細胞分化過程。于是我們采用蛋白酶體抑制劑MG132來研究泛素-蛋白酶

9、體通路與ATRA誘導的白血病細胞分化的確切關系。結果發(fā)現(xiàn),抑制ATRA對蛋白酶體的活化作用能明顯增強ATRA的誘導分化能力,說明增高的蛋白酶體活性并不利于ATRA誘導白血病細胞分化。進一步研究發(fā)現(xiàn),抑制ATRA對蛋白酶體的激活作用可以阻止維甲酸受體RARa及其融合蛋白PML-RARa的泛素化降解使其得到累積,從而增強ATRA誘導的白血病細胞分化作用。此外,采用基因轉染技術使細胞高表達維甲酸受體RARa,觀察白血病細胞內RARa蛋白表達水

10、平與細胞對ATRA的敏感程度相關性。結果表明,細胞內RARa蛋白含量的增多不僅能顯著降低ATRA作用濃度,還能加速分化進程,該結果證實細胞內RARa表達水平?jīng)Q定了白血病細胞對ATRA的敏感程度。
　　結論:全反式維甲酸在誘導白血病細胞分化過程中能激活泛素-蛋白酶體通路,而顯著增強的蛋白酶體活性可能對ATRA誘導的細胞分化產生不利的影響,因為抑制ATRA對蛋白酶體的活化作用能明顯促進ATRA對白血病細胞的誘導分化作用,其作用機制可能

11、與抑制維甲酸受體RARa蛋白的泛素化降解密切相關。
　　第二章蛋白酶體抑制劑聯(lián)合全反式維甲酸誘導人急性髓性白血病細胞分化的藥效學評價及機制研究
　　目的:基于第一部分的研究結果,本研究將在細胞水平和動物水平進一步確認蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合作用對人急性髓性白血病的誘導分化治療作用,并探討可能的分子作用機制,以期為臨床上ATRA聯(lián)合用藥方案提供新的策略。
　　方法與結果:我們通過細胞計數(shù)、NBT還原試驗、瑞氏-吉姆薩

12、染色和流式細胞術檢測細胞表面分化抗原CDllb表達等方法,在細胞水平證實蛋白酶體抑制劑PS341、Lactacystin和LLnL能顯著促進ATRA對人急性髓性白血病細胞HL60的誘導分化作用。采用人白血病HL60細胞裸小鼠移植瘤模型在動物水平證實PS341與ATRA聯(lián)合作用對白血病的誘導分化治療作用,兩藥聯(lián)合能顯著抑制移植瘤的生長,具有良好的協(xié)同作用。采用Western blot檢測PS341與ATRA聯(lián)合作用后HL60細胞內及裸小鼠

13、移植瘤組織中RARa蛋白表達水平,結果表明PS341能抑制RARa蛋白的泛素化降解使其累積,進而促進白血病細胞分化。熒光定量PCR結果表明,蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合作用后能促進RARa直接作用的靶基因STAT1和PU.1的基因轉錄,提示累積的RARa蛋白仍然具有生物學功能,與ATRA結合后能啟動下游基因的轉錄。蛋白酶體抑制劑還通過促進C/EBPa和C/EBPε這兩個與髓性細胞分化密切相關的核轉錄因子的表達,從而增強ATRA對白血病細

14、胞的誘導分化作用。此外,蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合作用能進一步抑制c-Myc蛋白表達,進而影響c-Myc下游相關蛋白Cyclin E、p27等蛋白水平,從而增強ATRA對白血病細胞G0/G1期阻滯作用。
　　結論:本實驗在體內外水平證明蛋白酶體抑制劑能夠明顯促進ATRA對人急性髓性白血病的誘導分化治療作用,具有良好的協(xié)同效果。其作用機制可能是通過抑制維甲酸受體RARa的泛素化降解使其得到累積,進而促進下游與分化相關基因(STAT

15、1和PU.1)的轉錄,從而促進細胞分化。蛋白酶體抑制劑還通過調節(jié)C/EBPa、C/EBPε、c-Myc、Cyclin E、p21和p27等蛋白表達進而增強ATRA對白血病細胞的誘導分化作用。
　　第三章蛋白酶體抑制劑聯(lián)合全反式維甲酸誘導人急性髓性白血病細胞凋亡作用及相關機制研究
　　目的:目前,ATRA結合化療的治療手段已成為急性髓性白血病治療領域研究的熱點問題。作為第一個成功應用于臨床蛋白酶體抑制,PS341表現(xiàn)出了顯著的

16、抗腫瘤治療作用。我們在前兩部分研究中觀察到,在適當?shù)臐舛认?對白血病細胞幾乎沒有殺傷作用),蛋白酶體抑制劑能夠明顯促進ATRA對人急性髓性白血病細胞的誘導分化作用。因此我們希望觀察蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合用藥對人急性髓性白血病細胞的誘導凋亡作用,進而全面掌握PS341與ATRA聯(lián)合應用的作用效果與藥物濃度之間的相關性,同時觀察給藥順序對兩藥聯(lián)合作用藥效的影響。
　　方法與結果:我們采用同時給藥和序貫給藥兩種方式觀察ATRA與蛋

17、白酶體抑制劑聯(lián)合作用對人急性髓細白血病細胞的誘導凋亡作用。結果發(fā)現(xiàn),同時給藥方案ATRA與PS341具有協(xié)同誘導白血病細胞凋亡的作用;而序貫給藥方式,ATRA預先作用后PS341對白血病細胞的誘導凋亡作用明顯受到抑制。通過比較PS341對正常的和經(jīng)ATRA預處理的NB4和HL60細胞蛋白酶體活性抑制情況,我們發(fā)現(xiàn)PS341均能顯著抑制細胞內蛋白酶體活性,說明ATRA對蛋白酶體活性的激活作用并不參與調節(jié)ATRA誘導的白血病細胞對蛋白酶體抑

18、制劑的耐受作用。通過Western blot檢測Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Bax和Mcl-1的蛋白水平變化。我們觀察到PS341作用后,Mcl-1蛋白呈時間依賴性遞增趨勢,提示Mcl-1蛋白并不參與調節(jié)PS341誘導的細胞凋亡過程;而ATRA作用后細胞內Bcl-2/Bax率顯著減少,但此時白血病細胞并沒有明顯的凋亡,說明這些蛋白并不是ATRA引起白血病細胞對PS341耐藥的影響因素。隨后,我們觀察到ATRA作用后細胞內p-MEK、c

19、-FLIP和Procaspase-8蛋白水平較對照組明顯增高。采用PD98059抑制MEK的磷酸化,經(jīng)ATRA預處理的白血病細胞對PS341的耐受作用明顯減弱,此時ATRA對c-FLIP和Procaspase-8蛋白表達的促進作用也受到抑制,說明ATRA通過磷酸化激活MEK蛋白,進而促進c-FLIP和Procaspase-8蛋白表達,從而抑制caspase-8引起的caspase級聯(lián)反應來抑制PS341對白血病細胞的誘導凋亡作用。