蛋白酶體抑制劑PS-341調(diào)控泛素-蛋白酶體途徑在重癥急性胰腺炎中的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：急性胰腺炎(AP)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病，臨床病理變化復(fù)雜，對(duì)治療的反應(yīng)也各不相同，輕型水腫性胰腺炎是一種自限性疾病，對(duì)治療反應(yīng)好，多數(shù)可以治愈，而重癥急性胰腺炎(SAP)起病急、進(jìn)展快，早期即可發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)、多器官功能不全(MODS)，雖然現(xiàn)在對(duì)SAP的治療較以前有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但死亡率仍高達(dá)10％-30％。 重癥急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，一直缺乏特異性的藥物作用靶點(diǎn)，其

2、臨床治療仍是一個(gè)國(guó)際性難題?，F(xiàn)今觀點(diǎn)認(rèn)為重癥急性胰腺炎的發(fā)病首先由胰蛋白酶在腺泡中異常活化引起胰腺腺泡細(xì)胞損傷，NF-kB活化、Ca2+濃度升高在這一過程中起重要作用；活化的NF-kB促使胰腺組織及炎性細(xì)胞釋放大量的炎性介質(zhì)如TNF-α，IL-6和ICAM-1等，炎性介質(zhì)問相互作用導(dǎo)致炎癥信號(hào)的進(jìn)一步放大；上述促炎癥介質(zhì)和同時(shí)產(chǎn)生的抗炎癥介質(zhì)如IL-2、IL-10、IL-1Ra等構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，兩者的平衡失調(diào)引最終導(dǎo)致胰腺損傷；

3、同時(shí)，大量細(xì)胞因子釋放入血、ROS、NO及COX-2的產(chǎn)生等將引起SIRS,過度SIRS造成遠(yuǎn)離組織器官的損傷，繼發(fā)MODS、膿毒血癥。據(jù)此，在疾病的早期應(yīng)用加貝脂、抑肽酶等蛋白酶抑制劑或細(xì)胞因子拮抗劑如TNF-α單克隆抗體、PAF拮抗劑等來(lái)治療重癥急性胰腺炎，從理論上講能夠減輕胰腺損傷、抑制炎癥反應(yīng)，但隨后大規(guī)模的臨床RCT研究證實(shí)這些治療方法均無(wú)效，其最主要的原因是細(xì)胞因子間都是相互作用、相互影響的，共同組成炎癥信號(hào)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，因

4、此抑制單一炎癥介質(zhì)活性并不能阻斷炎癥信號(hào)反應(yīng)系統(tǒng)介導(dǎo)的整個(gè)炎癥反應(yīng)的演進(jìn)過程。 NF-KB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，現(xiàn)被認(rèn)為在重癥急性胰腺炎的發(fā)病中起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。在正常細(xì)胞內(nèi)，NF-kB和它的抑制性蛋白I-kB相結(jié)合，以非活性的形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)菌、病毒、TNF-α、LPS等外源性刺激后，I-kB即發(fā)生磷酸化，進(jìn)而泛素化，泛素化后的1-kB出即可被26S proteasome識(shí)別并降解；至此，活化的NF-kB便移位到細(xì)胞

5、核中，結(jié)合到靶基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，激活細(xì)胞因子、粘附分子和COX-2等的表達(dá)。26S proteasome是細(xì)胞內(nèi)最主要的非溶酶體溶蛋白酶復(fù)合物，其通過細(xì)胞周期時(shí)限特異性的生物學(xué)機(jī)制精確的調(diào)控細(xì)胞內(nèi)70-90％的蛋白降解，NF-kB的抑制因子I-kB及許多與細(xì)胞周期循環(huán)和凋亡相關(guān)的重要因子、轉(zhuǎn)錄因子等都經(jīng)此泛素-proteasome途徑降解。Bortezomib,又稱PS-341，是一種強(qiáng)效、高度選擇性的proteasome抑制劑，它通

6、過和26S proteasome的20S亞基快速、可逆的結(jié)合抑制酶復(fù)合物的活性，進(jìn)而抑制了I-kB的降解，使NF-kB活性受到抑制，降低了TNF-α、IL-1、IL-8、COX-2等的表達(dá)，并可通過抑制P21、P27、P53、Bax降解和激活JNK等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。2003年5月13日PS-341已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床用于多發(fā)行骨髓瘤的治療，現(xiàn)臨床Ⅲ期驗(yàn)證已經(jīng)取得令人滿意的效果，這是第一個(gè)也是目前唯一一個(gè)進(jìn)入臨床的proteas

7、ome抑制劑，其相關(guān)研究獲得了2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。鑒于調(diào)控著體內(nèi)許多細(xì)胞因子的產(chǎn)生和活化、并在重癥胰腺炎的發(fā)病中起著關(guān)鍵性作用NF-kB為Proteasome的重要作用靶點(diǎn)之一，而PS-341為目前公認(rèn)的特異性最強(qiáng)的proteasome抑制劑，因此，本課題擬利用PS-341能夠特異性抑制NF-kB活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制來(lái)驗(yàn)證和闡釋PS-341對(duì)SAP的治療保護(hù)作用，并通過micro PET這一先進(jìn)的影像學(xué)檢查方法直接觀察PS-

8、341在小鼠體內(nèi)對(duì)胰腺微循環(huán)和炎細(xì)胞活性的影響，以期PS-341能夠成為一種新的治療重癥急性胰腺炎的有效手段，從而推動(dòng)SAP治療研究的進(jìn)展。 本實(shí)驗(yàn)主要包括兩部分研究?jī)?nèi)容：第一部分：PS-341對(duì)小鼠重癥急性胰腺炎的治療作用；第二部分：18F-FDG-PET在重癥急性胰腺炎早期診斷和療效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值。 第一部分 PS-341對(duì)小鼠重癥急性胰腺炎的治療作用 實(shí)驗(yàn)材料和方法：健康雌性ICR小鼠144只，體重20g

9、±1g。隨機(jī)分為PS-341治療組，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組，其中PS-341治療組64只，模型對(duì)照組40只，空白對(duì)照組40只。重癥急性胰腺炎模型的建立通過連續(xù)7次腹腔注射50ug／kg雨蛙素，每次間隔一小時(shí)，并在首次注射雨蛙素5小時(shí)后腹腔注射10mg／kg脂多糖。 為了確定PS-341的最佳有效濃度，不同劑量的PS．341(0.1，0.2，0.5，1.0mg／kg)在注射脂多糖半小時(shí)前腹腔內(nèi)注入，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組分別注射同

10、等劑量的安慰劑，首次雨蛙素注射后8小時(shí)取血和胰腺組織，測(cè)血清淀粉酶、CRP和LDH。為了驗(yàn)證PS-341治療的最佳有效作用時(shí)間，分別于用藥后8小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)將小鼠用50mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取血、胰腺和肺組織，而后通過組織病理檢測(cè)和western blot、ILISA、RT-PCR等經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)驗(yàn)證PS-341對(duì)小鼠重癥急性胰腺炎的治療作用。 結(jié)果：本研究發(fā)現(xiàn)，PS-341的最佳有效濃度為0.5mg／

11、kg，造模后8小時(shí)治療效果最好。雨蛙素聯(lián)合脂多糖小鼠腹腔內(nèi)注射后，小鼠胰腺呈現(xiàn)典型的出血、壞死病理表現(xiàn)，血淀粉酶值明顯升高，造模后小鼠肺臟病理結(jié)構(gòu)改變表現(xiàn)為肺不張，肺泡滲出增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。生化及分子生物學(xué)檢測(cè)示血清淀粉酶、C-反應(yīng)蛋白、乳酸脫氫酶、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、胰腺組織中細(xì)胞黏附分子ICAM-1的表達(dá)都較空白對(duì)照組明顯升高。PS-341治療后，胰腺組織中I-kB降解減少， NF-kB活性顯著下降，胰腺出血、壞

12、死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，肺泡滲出減少。血清淀粉酶、C-反應(yīng)蛋白、乳酸脫氫酶、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、胰腺組織中細(xì)胞黏附分子ICAM-1的表達(dá)都較對(duì)照組顯著下降，而組織中細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多。 結(jié)論：雨蛙素聯(lián)合脂多糖腹腔注射誘導(dǎo)小鼠重癥急性胰腺炎模型是一種經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法。PS-341治療后能夠明顯減輕重癥急性胰腺炎的嚴(yán)重程度，血清淀粉酶、C-反應(yīng)蛋白、乳酸脫氫酶、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、胰腺組織中細(xì)胞黏附分子IC

13、AM-1的表達(dá)顯著下降，組織病理?yè)p傷也明顯減輕，因此，PS-341有可能成為新的治療重癥急性胰腺炎的有效藥物，并在臨床得到推廣應(yīng)用。 第二部分18F-FDG-PET在重癥急性胰腺炎早期診斷和療效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值 實(shí)驗(yàn)材料和方法：健康雌性ICR小鼠33只，體重20g±1g，隨機(jī)分為PS-341治療組，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組11只。重癥急性胰腺炎模型的建立同上，空白對(duì)照組用等量的生理鹽水代替雨蛙素和脂多糖腹腔注射。PS

14、-341 (0.5mg/kg)在脂多糖注射前半小時(shí)腹腔內(nèi)注入，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組分別注射同等劑量的安慰劑。首次雨蛙素注射后8小時(shí)，將小鼠用50mg／kg的戊巴比妥鈉腹腔麻醉，每組3只行PET胰腺掃描，另外8只取胰腺組織，勻漿后測(cè)MPO。 結(jié)果：正常對(duì)照組PET掃描時(shí)胰腺不顯影，當(dāng)誘導(dǎo)建立重癥急性胰腺炎模型后，胰腺。18F-FDG的吸收率明顯增高，PET圖像上胰腺呈一鮮亮條帶；PS-341治療后胰腺18F-FDG的吸收率顯著降低