天然蛋白酶體抑制劑抑制XIAP增強(qiáng)TNFα抗腫瘤作用的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　慢性炎癥部位易發(fā)生腫瘤，約20％的腫瘤發(fā)生與慢性炎癥有關(guān)，有許多癌癥患者多數(shù)有慢性炎癥史，當(dāng)炎癥遷延，癌癥的發(fā)生率增加。流行病學(xué)及分子生物學(xué)研究均證明炎癥和腫瘤存在著聯(lián)系。從流行病學(xué)的角度分析，慢性炎癥患者更容易繼發(fā)各種腫瘤，大約15％～20％的腫瘤患者都存在潛在的炎癥。近年來(lái)科學(xué)家們對(duì)腫瘤炎癥微環(huán)境的關(guān)注越來(lái)越多，在腫瘤形成過程中，炎癥細(xì)胞通過分泌各種炎癥因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，產(chǎn)生有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境

2、，促使正常細(xì)胞發(fā)生基因突變，促進(jìn)血管生成。在腫瘤微環(huán)境中，炎癥細(xì)胞、炎癥趨化因子、細(xì)胞因子等對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、分化等起到一定的調(diào)節(jié)作用，腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演著重要角色。TNF-α（腫瘤壞死因子）,是一個(gè)關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子,其在這一過程中起著重要作用。研究TNF-α對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，并深入探討其對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響，以期可以更確切的闡述炎癥介質(zhì)TNF-α在癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中的作用。<

3、br>　　近些年關(guān)于天然蛋白酶體抑制劑的報(bào)道較多，其通過抑制蛋白酶體的活性干擾和影響細(xì)胞原有的功能。天然蛋白酶體抑制劑Withaferin(WA)醉茄素和Celastrol雷公藤紅素對(duì)炎癥和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，其抗炎和抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)。值得注意的是WA醉茄素和Celastrol雷公藤紅素的這些抑制活性機(jī)制包括但不局限于其抑制蛋白酶體活性的機(jī)制。
　　我們課題主要研究的是TNF-α與這兩種天然藥物的結(jié)合

4、對(duì)體外癌細(xì)胞的影響。就目前我們的研究結(jié)果顯示：TNF-α與WA或Celastrol聯(lián)合使用時(shí)可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活，進(jìn)而抑制了NF-κB下游基因XIAP的表達(dá)，間接的WA/Celastrol解除了XIAP對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中的caspase-3和9的抑制即上調(diào)caspase-3和9的活性最終增敏了TNF-α對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。這一系列的生物化學(xué)反應(yīng)與WA/Celastrol對(duì)蛋白酶

5、體的抑制作用密切相關(guān)，尤其是與它們明顯增加蛋白酶體靶蛋白IκBα的積累量密切相關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō),這些結(jié)果表明TNF-α可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)WA或Celastrol敏感性在某種程度上來(lái)說(shuō)是通過抑制NF-κB信號(hào)的激活從而導(dǎo)致了XIAP的抑制最終上調(diào)了caspase-3和9的活性。因此,TNF-α的抗癌活性在與天然的蛋白酶體抑制劑WA或Celastrol結(jié)合時(shí)增強(qiáng)。
　　方法:
　　1.無(wú)菌培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，將不同

6、濃度的WA或celastrol分別與固定濃度的TNF-α聯(lián)用或不聯(lián)用并設(shè)立空白對(duì)照組，各組進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的活性、增殖、遷移；
　　2.無(wú)菌培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，將不同濃度的WA或celastrol分別與固定濃度的TNF-α聯(lián)用或不聯(lián)用并設(shè)立空白對(duì)照組，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡；
　　3.無(wú)菌培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，將不同濃度的WA或ce

7、lastrol分別與固定濃度的TNF-α聯(lián)用或不聯(lián)用并設(shè)立空白對(duì)照組，Western blot檢測(cè)PARP、caspase-9、caspase-3、泛素化蛋白的表達(dá)情況；
　　4.無(wú)菌培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，將不同濃度的WA或celastrol分別與固定濃度的TNF-α聯(lián)用或不聯(lián)用并設(shè)立空白對(duì)照組，逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)XIAP及相關(guān)基因表達(dá)量；
　　5.無(wú)菌培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，將不同濃度

8、的WA或celastrol分別與固定濃度的TNF-α聯(lián)用并設(shè)立空白對(duì)照組，利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western bloting檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子NFKBP65的轉(zhuǎn)位情況；
　　6.無(wú)菌培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，將不同濃度的WA或celastrol分別與固定濃度的TNF-α聯(lián)用或不聯(lián)用并設(shè)立空白對(duì)照組，Western bloting檢測(cè)XIAP、cIAP1/2、IKB及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.TN

9、F-α增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231對(duì)WA/celastrol的敏感性，抑制了乳腺癌癌細(xì)胞的增殖和遷移；
　　2.TNF-α增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231對(duì)WA/celastrol的敏感性，促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的凋亡；
　　3.聯(lián)合的TNF-α與WA/celastrol通過影響凋亡蛋白caspase-3的活性和表達(dá)水平促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的凋亡；
　　4.聯(lián)合的TNF-α與WA/celastrol對(duì)蛋白酶體的活性具有一

10、定的抑制作用；
　　5.TNF-α聯(lián)合WA/Celastrol在較久的時(shí)間點(diǎn)影響XIAP蛋白的表達(dá)
　　6.聯(lián)合的TNF-α與WA/Celastrol對(duì)基因XIAP的表達(dá)具有一定的抑制作用
　　7.聯(lián)合的TNF-α與WA/celastrol抑制了核轉(zhuǎn)錄因子NFKBP65的核轉(zhuǎn)位；
　　8.WA/Celastrol抑制了TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB通路的活化。
　　結(jié)論:
　　我們的研究證實(shí)了天然蛋白酶體

11、抑制劑WA/Celastrol可以使乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231對(duì)TNF-α的抗腫瘤作用變得敏感，從而促進(jìn)其凋亡。WA/Celastrol主要通過對(duì)蛋白酶體的抑制作用從而抑制了IκBα的磷酸化使其不能降解，由于IκBα是NF-κB的抑制物之一，IκBα的積累則可以阻斷NF-κB通路的活化從而使NF-κB下游的基因的表達(dá)也受到一定的抑制，尤其是對(duì)XIAP、cIAP1/2基因表達(dá)的間接抑制。之前已有報(bào)道指出XIAP可與凋亡啟動(dòng)因子casp