蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)高氧肺損傷的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景： 氧是我們機(jī)體重要的組成元素，氧氣在能量代謝中起關(guān)鍵的作用。在生理?xiàng)l件下，肺泡上皮細(xì)胞有氧代謝過(guò)程中活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)處于一種低水平激活狀態(tài)，為了降低氧損傷，機(jī)體有完善的抗氧化系統(tǒng)清除氧化產(chǎn)物。然而，過(guò)度激活ROS會(huì)破壞抗氧化系統(tǒng)而損傷細(xì)胞內(nèi)組成，最終引起細(xì)胞死亡，組織炎癥反應(yīng)和損傷。濕潤(rùn)的支氣管和肺泡上皮細(xì)胞直接接觸高氧環(huán)境是最容易受氧化激活損傷。蛋白的氧化損傷和肺生理功能的喪

2、失是高氧肺損傷的結(jié)局之一。目前的研究多數(shù)集中于探討抗氧化酶如何減輕高氧引起的氣道損傷，譬如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶或谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等。在高氧暴露早期為了維持肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，清除氧化損傷蛋白的生物途徑可能充當(dāng)了重要的作用。 泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-ProteasomePathway，UPP)是一種高效的蛋白分解途徑，是一種清除損傷或陳舊蛋白質(zhì)的重要途徑，廣泛存在于細(xì)胞胞漿、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。該通路參

3、與NF-κB通路的激活，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB通路在高氧肺損傷病理變化中起著重要的作用。然而，泛素-蛋白酶體通路是否直接參與高氧肺損傷的病理過(guò)程，尚不清楚。在高氧肺損傷的發(fā)病過(guò)程中氧化應(yīng)激與泛素蛋白酶體通路功能之間的關(guān)系尚未闡明；蛋白酶體抑制劑是否能通過(guò)抑制泛素-蛋白酶體通路，影響多種炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的高氧肺損傷的病理生理學(xué)過(guò)程?目前，MG-132作為蛋白酶體的抑制劑，用于高氧肺損傷的研究，尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。因此，我們提出假說(shuō)：如果泛素蛋白酶體通路參

4、與高氧肺損傷的病理過(guò)程，那么抑制其活性，有可能會(huì)減少炎癥因子的激活，減輕高氧導(dǎo)致的肺損傷。 目的： (1)觀察高氧暴露早期對(duì)肺臟的影響。 (2)通過(guò)觀察泛素-蛋白酶體通路是否激活，進(jìn)一步觀察蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)高氧暴露肺組織形態(tài)學(xué)和氧化激活指標(biāo)的影響，探討蛋白酶體抑制劑MG-132是否對(duì)高氧肺損傷有影響。 (3)同時(shí)觀察肺組織嗜中性白細(xì)胞侵潤(rùn)情況，以及NF-κB/炎癥因子通路的變化，進(jìn)一步探討蛋白

5、酶體抑制劑MG-132可能的作用機(jī)制。 方法： (1)建立高氧肺損傷大鼠模型。 (2)實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。SD大鼠30只，分為3組，每組10只大鼠。(1)空氣對(duì)照組：持續(xù)吸入空氣(FiO2=0.21)72小時(shí)，于實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始腹腔內(nèi)注射DMSO0.25ml，注射3天；(2)高氧組：持續(xù)吸入高濃度氧(FiO2>0.95)72小時(shí)，于實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始腹腔內(nèi)注射DMSO0.25ml，注射3天；(3)高氧+MG-132組

6、：于實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始腹腔內(nèi)注射MG-132(10mg/kg·d，溶解于DMSO0.25ml，注射3天)，其余處理同高氧組。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后0、24、48、72小時(shí)觀察大鼠心率、呼吸變化，其余指標(biāo)均于72小時(shí)時(shí)檢測(cè)。 (3)為了評(píng)價(jià)模型我們用心電監(jiān)護(hù)觀察大鼠心率、呼吸變化：進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察：大體病理分級(jí)，進(jìn)行肺損傷病理評(píng)分；測(cè)定肺水腫指標(biāo)肺濕/干重比例。 (4)測(cè)定肺勻漿丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性間接反映肺

7、組織氧化損傷和氧化應(yīng)激情況。 (5)免疫組織化學(xué)方法和Westernblot方法檢測(cè)肺組織泛素化蛋白(Ubiquitin/Ubiquitin-Conjugates)的表達(dá)，檢測(cè)蛋白酶體20S的活性，評(píng)價(jià)泛素-蛋白酶體途徑激活情況。 (6)檢測(cè)肺組織勻漿髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織NF-κBp65表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)肺組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，反映肺組織NF-κB/炎癥因子通路的活

8、化情況。 結(jié)果： (1)成功復(fù)制高氧肺損傷大鼠模型： (2)大鼠高氧暴露后，呼吸、心率逐漸增快(P<0.01)，出現(xiàn)明顯肺水腫，肺濕/干重比例增高(P<0.01)。與高氧組比較，實(shí)驗(yàn)72小時(shí)時(shí)高氧+MG-132組大鼠呼吸、心率相對(duì)減慢(P<0.05)，肺水腫減輕，肺濕/干重比例降低(P<0.01)。 (3)肉眼觀察：高氧模型組3天肺組織鮮紅色，飽滿狀，表面有點(diǎn)片狀出血或局灶狀出血，胸腔有少量積液。大體病理

9、分級(jí)高氧組與空氣組差異有顯著性(P<0.01)。光鏡觀察：高氧組肺泡上皮腫脹，肺泡壁肺泡壁增寬、毛細(xì)血管擴(kuò)張和充血，肺泡間質(zhì)和肺泡腔水腫明顯，肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞增多。肺損傷病理評(píng)分結(jié)果提示損傷較空氣組嚴(yán)重(P<0.01)。蛋白酶體抑制劑MG-I32可以減輕高氧所致肺損傷，大體病理分級(jí)與高氧組比較有顯著差異(P<0.01)，肺損傷病理評(píng)分結(jié)果也提示損傷較高氧組減輕(P<0.01)。 (4)與空氣組比較，高氧組肺組織勻漿MDA水平(P<

10、0.01)、SOD活性(P<0.01)增高。高氧+MG-132組肺組織勻漿MDA水平、SOD活性與高氧組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (5)免疫組化和Westernblot結(jié)果均顯示大鼠高氧暴露72小時(shí)肺組織泛素化蛋白表達(dá)增強(qiáng)(均P<0.01)。蛋白酶體抑制劑MG-132增強(qiáng)其表達(dá)(免疫組化和WesternblotP值分別為0.000，0.022)。 (6)高氧組蛋白酶體20S活性較空氣組明顯升高(P<0.01)。蛋白酶體抑制

11、劑MG-132抑制其活性(P<0.01)。 (7)高氧組MPO活性、NF-κB表達(dá)均較空氣組增強(qiáng)(均P<0.01)，同時(shí)炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)也增強(qiáng)(均P<0.01)。蛋白酶體抑制劑MG-132抑制了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低了MPO活性(P<0.05)，抑制了肺組織中NF-κB的表達(dá)(P<0.05)，下調(diào)了炎癥因子TNF-α(P<0.05)、IL-6(P<0.05)的表達(dá)。 結(jié)論： (1)高氧暴露72小時(shí)