蛋白酶體抑制劑MG-132對結腸癌細胞株lovo細胞腺病毒柯薩奇病毒受體表達的影響.pdf

1、目的： 以腺病毒為載體的基因治療療效備受爭議。在大多數情況下，腺病毒轉染靶細胞依賴于其主要受體--腺病毒柯薩奇病毒受體(CAR)的表達。然而，在許多惡性腫瘤細胞中CAR的表達水平較低，低水平的CAR表達被認為是以腺病毒為載體的基因治療療效不佳的原因之一。因此，提高CAR在腫瘤細胞的表達成為增強腺病毒基因治療療效研究中一個非常具有希望的方向。蛋白酶體是真核細胞蛋白降解的主要場所。最近隨著一些選擇性蛋白酶體抑制劑的問世，為研究泛素．

2、蛋白酶體途徑在不同信號通路中的作用提供了可能。目前，尚未見有關蛋白酶體抑制劑類藥物對CAR．表達影響的報道。在本研究中，我們運用免疫組化的方法分析了CAR在結腸癌組織中的表達，并進一步分析蛋白酶體抑制劑MG-132對結腸癌細胞株Iovo細胞CAR表達的影響。 方法： 采用免疫組織化學的方法檢測CAR在結腸腫瘤中的表達，分析CAR的表達與臨床及病理特征之間的關系。預先進行藥敏實驗以確定MG-132及TSA(trichost

3、atin A，曲古抑菌素，陽性對照用藥)對腫瘤細胞株的最低有效劑量。運用流式細胞法、RT-PCR法及western blot法檢測CAR在經MG-132或TSA處理前后的表達情況。為進一步定性及定量分析經MG-132或TSA處理后腺病毒的轉染效率，我們使用重組增強綠色熒光蛋白腺病毒(tAd．EGFP)轉染靶細胞后，采用熒光顯微鏡及流式細胞儀分析其轉染效率。為分析經MG-132或TSA處理后對腺病毒藥物體外效果的影響，我們使用重組人p53

4、腺病毒(tAd．p53)或溶瘤型腺病毒轉染靶細胞，運用western blot法分析經rAd．p53轉染后p53及p21的表達情況，運用MTT法檢測溶瘤型腺病毒的體外抗腫瘤效應。 結果： 與瘤旁結腸上皮組織相比，結腸腫瘤組織中普遍存在著CAR的表達丟失或下調(p<0.01)，但CAR在原發(fā)灶及淋巴結轉移灶中的表達水平并無明顯差異。此外，結腸腫瘤組織中CAR的表達丟失或下調還與患者的年齡(p=0.0395)及腫瘤大小(p=

5、0.0115)密切相關。 本實驗中MG-132或TSA所用劑量對腫瘤細胞沒有或僅有較小細胞毒性。FCM分析lovo細胞經MG-132(1.5umol/L)或TSA(30ng/ml)處理兩天后CAR的表達情況，lovo細胞CAR的陽性表達率由處理前的3.4±1.0％分別升至23.5±2.6％和36.5±2.6％。運用RT-PCR及western blot法分析藥物處理前后CARmRNA及蛋白質表達的變化發(fā)現，lovo細胞經TSA處

6、理后，其CAR mRNA及蛋白質的水平皆得到不同程度的提高。lovo細胞經MG-132處理后并不能提高CAR mRNA的表達水平，但同樣也能提高CAR蛋白質的表達水平。我們運用25、50或100 MOI的rAd．EGFP轉染lovo細胞證實，經MG-132或TSA處理后能夠提高目的基因的表達水平。在50 MOI的情況下，未加藥物處理組、MG-132處理組及TSA處理組GFP的表達率分別為：26.5±2.1％、49.7±5.3％和62.1

7、±7.0％。此外，rAd．p53與MG-132或TSA聯(lián)合應用時，能夠明顯地提高p53及p21的表達水平。lovo細胞經或不經MG-132或TSA處理后，在體外轉染50 MOI的溶瘤型腺病毒，結果顯示：藥物處理組lovo細胞的生長抑制率較對照組明顯提高。 結論： 在結腸腫瘤組織中普遍存在CAR的表達丟失或下調，提示在設計腺病毒載體基因治療方案時應充分考慮CAR表達變化對療效的影響。與TSA相比，蛋白酶體抑制劑MG-132