HER2抑制劑TAK165協(xié)同全反式維甲酸誘導(dǎo)人急性髓系白血病細胞分化的藥效及其機制研究.pdf

1、研究目的:
　　急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia，AML)是一種血液系統(tǒng)腫瘤，嚴重威脅人類生命健康。AML的重要標(biāo)志是存在嚴重的髓系分化障礙。所以，目前認為可以將誘導(dǎo)分化治療作為臨床治療AML的一種有效的治療策略。全反式維甲酸（All-transretinoic acid，ATRA）是第一個成功用于臨床治療急性早幼粒細胞白血病（Acute promyelocytic leukemia，APL，A

2、ML型M3）的分化誘導(dǎo)劑。然而，APL患者在大量使用ATRA時會出現(xiàn)金反式維甲酸耐藥、復(fù)發(fā)等現(xiàn)象，同時還會產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)。此外，ATRA除了對APL患者有較好的療效，對于AML的其他亞型，都沒有顯著的治療效果。因此，尋找更為高效低毒的誘導(dǎo)分化藥物或采用藥物聯(lián)合方案完善維甲酸誘導(dǎo)分化治療策略是解決上述問題的關(guān)鍵途徑。
　　人表皮生長因子受體2(HER2)是ErbB家族中的重要成員，參與細胞生長，增殖，粘附和分化等重要生命過程

3、的調(diào)控。有文獻報道，抑制HER2的信號通路對白血病可能有潛在的治療作用。TAK165(Mubritinib)是一種HER2的特異抑制劑，其應(yīng)用于腫瘤的治療目前仍處于臨床研究階段。有文獻報道，TAK165可以通過介導(dǎo)細胞凋亡，進而針對包括AML在內(nèi)的多種腫瘤細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，關(guān)于TAK165調(diào)控ATRA介導(dǎo)的AML細胞分化目前尚沒有文獻報道。因此，本課題擬通過實驗研究HER2抑制劑TAK165(Mubritinib)與ATRA聯(lián)合

4、應(yīng)用，誘導(dǎo)AML細胞的分化效應(yīng)，并進一步探討其內(nèi)在的分子機制。
　　研究方法:
　　選用人白血病細胞株HL60和NB4為主要研究對象，考察TAK165對于AML細胞的增殖以及周期分布的影響，并檢測TAK165與ATRA合用對于AML細胞的誘導(dǎo)分化作用。采用臺盼藍拒染法結(jié)合血細胞計數(shù)板計數(shù)檢測細胞增殖情況，描繪細胞生長曲線和存活率曲線;細胞經(jīng)碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測了細胞周期分布

5、的變化情況;應(yīng)用Western blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白和分化相關(guān)蛋白(c-Myc、p21、p27、C/EBPβ、PU.1)的表達;細胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后通過流式細胞術(shù)檢測細胞表面分化抗原CD11b的表達;應(yīng)用硝基四氮唑藍(NBT)還原法檢測細胞分化能力;應(yīng)用瑞氏-吉姆薩染色法檢測細胞形態(tài)學(xué)變化;應(yīng)用Real-time PCR檢測細胞內(nèi)分化相關(guān)因子(PU.1，C/EBPB、C/EBPE)的mRNA表達水平;
　　選用

6、人白血病細胞株HL60和NB4為主要研究對象，考察TAK165和ATRA誘導(dǎo)AML細胞分化的分子機制。細胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后通過流式細胞術(shù)檢測細胞表面分化抗原CD11b的表達;應(yīng)用硝基四氮唑藍(NBT)還原法檢測細胞分化能力;應(yīng)用Real-time PCR檢測細胞內(nèi)RARB、PXN的mRNA表達水平;應(yīng)用Western blot檢測HER2，RARα蛋白表達水平，檢測分化啟動因子STAT1表達及活化水平（STAT1、p-STA

7、T1 S727），MAPK家族蛋白表達以及活化水平(MEK、p-MEK、ERK、 p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK);利用HER2單克隆抗體藥物赫賽汀研究HER2靶點在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細胞分化中的作用。用攜帶pCCL-RARα的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HL60R細胞，通過過表達RARα檢測其在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細胞分化過程中的作用。用攜帶shRNA-STAT1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染NB4細胞，通過

8、沉默STAT1檢測其在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細胞分化過程中的作用。選用MEK/ERK特異性抑制劑PD98059和U0126、p38特異抑制劑SB203580和JNK特異性抑制劑SP600125，研究MAPK信號通路在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)AML細胞分化過程中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1) TAK165引起AML細胞增殖抑制、周期阻滯，而不會引起明顯的細胞死亡。
　　TAK165作用于HL60和

9、NB4細胞，通過臺盼藍拒染法結(jié)合血細胞計數(shù)板計數(shù)，結(jié)果顯示TAK165會引起細胞增殖抑制，而且抑制程度呈劑量依賴性和濃度依賴性，但是不會引起明顯的細胞死亡。通過PI單染結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布的變化，結(jié)果顯示TAK165能夠使HL60和NB4細胞周期阻滯于G0/G1期。Westem blot檢測周期相關(guān)蛋白(c-Myc、p21、p27)的表達變化，顯示TAK165作用于HL60和NB4細胞，c-Myc蛋白表達下調(diào)，p21、p27表

10、達上調(diào)，確證了TAK165可以使HL60和NB4細胞發(fā)生周期阻滯。
　　2) TAK165協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細胞分化。
　　TAK165與ATRA聯(lián)合作用于HL60和NB4細胞，通過血細胞計數(shù)板計數(shù)法，計數(shù)并描繪細胞生長曲線，結(jié)果表明TAK165可以明顯促進ATRA引起的HL60和NB4細胞的增殖抑制作用。通過PI染色法檢測細胞周期分布變化，TAK165可以協(xié)同ATRA使HL60和NB4細胞周期阻滯于G0/G1期。我們從

11、分子標(biāo)志、生化功能、形態(tài)學(xué)和細胞分化相關(guān)基因和蛋白的表達情況幾方面確證了TAK165可以增強ATRA引起HL60和NB4細胞分化的作用。ATRA單獨作用于HL60和NB4細胞72小時，CD11b陽性率分別為24.8％±3.0％，而TAK165與ATRA聯(lián)合應(yīng)用時，CD11b陽性率達到80.0％±3.4％。TAK165與ATRA聯(lián)合作用時，NBT還原能力也較TAK165和ATRA單獨作用時明顯增強，NBT陽性細胞比例由21.30％±2.4

12、5％到93.40％±1.19％。瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果顯示，TAK165與ATRA作用于HL60和NB4細胞，引起細胞胞體變小，細胞核固縮，核質(zhì)比例下降，而且TAK165與ATRA合用引起的細胞形態(tài)學(xué)變化與單用組相比更為明顯。此外，通過Realtime-PCR和Western blot檢測細胞分化相關(guān)基因(CEBPB、CEBPE、PU.1)，分化相關(guān)蛋白（C/EBPβ、PU.1）的表達情況，發(fā)現(xiàn)TAK165與ATRA聯(lián)合作用使分化相關(guān)基因

13、上調(diào)，相關(guān)蛋白的表達增加，確證了TAK165可以協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細胞分化。
　　3) TAK165協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細胞分化的機制研究。
　　通過Western blot檢測HL60和NB4細胞中HER2蛋白表達，結(jié)果顯示與HER2高表達的乳腺癌BT474相比，在AML細胞中幾乎檢測不到HER2蛋白的表達。加入HER2單克隆抗體藥物赫賽汀后，PI染色檢測周期分布結(jié)果顯示，赫賽汀既不能協(xié)同ATRA引起細胞周期阻滯，也

14、不會對TAK165和ATRA引起的G0/G1周期阻滯有明顯的促進作用。與之相對應(yīng)的，加入赫賽汀后，CD11b陽性細胞比率也沒有明顯變化。以上結(jié)果說明，TAK165并不是通過抑制HER2來促進ATRA誘導(dǎo)AML細胞分化。
　　RT-PCR檢測細胞內(nèi)RARα靶基因表達的結(jié)果顯示，與TAK165和ATRA協(xié)同誘導(dǎo)分化效應(yīng)一致，在HL60和NB4細胞中，RARB和PXN在TAK165與ATRA聯(lián)合作用時均發(fā)生明顯協(xié)同上調(diào)。而在RARα突變

15、的HL60R細胞中，給藥后RARB和PXN的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化。同時，TAK165與ATRA也不會引起HL60R細胞分化，CD11b陽性率由3.05±0.35％到10.98±0.10％。當(dāng)在HL60R細胞中過表達RARα后，與對照組相比，細胞內(nèi)RARB和PXN基因水平發(fā)生了明顯上調(diào)，同時CD11b陽性率也從35.33±0.25％增強至67.02±4.94％。以上結(jié)果說明，RARα的激活參與了TAK165協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細胞分化的

16、過程。
　　Western blot結(jié)果顯示，TAK165與ATRA作用于NB4細胞，協(xié)同上調(diào)了STAT1蛋白S727位點磷酸化水平。慢病毒介導(dǎo)的shRNA-STAT1顯著下調(diào)了NB4細胞中STAT1蛋白的表達水平。通過NBT還原實驗以及CD11b的檢測，結(jié)果顯示STAT1的敲除使TAK165對ATRA誘導(dǎo)細胞分化的協(xié)同作用發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果顯示，STAT1的激活在TAK165與ATRA協(xié)同誘導(dǎo)分化的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

17、>　　Western blot檢測結(jié)果表明，TAK165與ATRA聯(lián)合作用于HL60和NB4細胞時，可以激活MEK/ERK信號通路，p-MEK、p-ERK蛋白水平均會協(xié)同上調(diào)，而其相應(yīng)原型蛋白水平不變。然而JNK和p38信號通路在這一過程中不會被激活，蛋白水平以及磷酸化水平均不變。JNK特異性抑制劑sp600125和p38特異性抑制劑SB203580對于TAK165和ATRA協(xié)同誘導(dǎo)分化效應(yīng)影響不大。但是加入MEK特異性抑制劑PD980

18、59，U0126后，TAK165與ATRA合用組細胞分化水平有明顯的下降，CD11b陽性率從82.37％±0.37％到56.22％±0.68％，36.5％±2.88％。此外，Western bolt結(jié)果顯示，PD98059和U0126作用與NB4細胞后，會明顯抑制TAK165和ATRA合用引起的STAT1蛋白發(fā)生磷酸化激活。以上結(jié)果說明，MEK/ERK信號通路通過調(diào)控了STAT1的活性，進而影響了TAK165和ATRA協(xié)同誘導(dǎo)分化過程。