CDK2泛素化降解在全反式維甲酸誘導急性髓性白血病細胞分化中的作用研究.pdf

1、研究目的:
　　 急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia,AML)的重要標志為嚴重的髓系分化障礙,因此誘導分化治療是目前公認的針對AML的有效治療策略。利用全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)治療早幼粒細胞白血病(acutepromyeloidleukemia,APL,M3型AML)是誘導分化治療策略用于臨床實踐的最成功范例。由于ATRA在臨床應用上的巨大成功,深入研究ATRA誘

2、導細胞分化的分子機制,進一步發(fā)現(xiàn)誘導分化治療的潛在靶標,完善誘導分化治療策略是許多腫瘤學家追求的重要目標。
　　 現(xiàn)代分子生物學研究發(fā)現(xiàn)ATRA誘導白血病細胞分化過程中往往伴隨有細胞退出增殖周期,即細胞周期阻滯于G0/G1期。因此細胞周期調(diào)控因子在ATRA誘導分化中的作用成為該領域的研究熱點之一。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道,細胞周期蛋白依賴激酶活化激酶(Cyclin-dependentkinase-activatingkinase,CAK

3、)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21WAF1/Cip-1、p27Kipl和CyclinE等都被認為在ATRA誘導細胞分化過程中發(fā)揮重要作用.但細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependentkinases,CDKs)是否在該過程中發(fā)揮作用目前仍無文獻報道。
　　 細胞周期蛋白依賴激酶2(Cyclin-dependentkinase2,CDK2)屬于CDK絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,是細胞G1/S期轉(zhuǎn)換過程中的重要調(diào)

4、控因子。CDK2可分別結(jié)合于CyclinE和CyclinA,隨后CAK磷酸化其蘇氨酸160位(Thr-160)而被激活,通過磷酸化眾多底物而促進G1/S期的進程。然而除在細胞周期中發(fā)揮重要作用外,近年來CDK2也被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控細胞自我更新和分化中起到關(guān)鍵作用。一些文獻報道CDK2活性或表達可促進鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞、胚胎干細胞、小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細胞和成年小鼠的髓鞘等的分化。
　　 泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-protea

5、somesystem,UPS)是真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑。通過選擇性降解并調(diào)控細胞內(nèi)蛋白,UPS廣泛地參與細胞的生長、分化、凋亡、周期調(diào)控、炎癥反應等重要的生命活動過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),ATRA誘導AML細胞分化和G0/G1周期阻滯的過程中伴隨有CDK2蛋白水平的明顯下降,而同時抑制蛋白酶體活性,CDK2下調(diào)的趨勢被明顯逆轉(zhuǎn),提示CDK2在ATRA作用后可能通過UPS發(fā)生降解。關(guān)于CDK2的降解機制及其在ATRA誘導細

6、胞分化中的作用目前均尚無文獻報道。
　　 因此,本課題的研究將分兩部分探討ATRA誘導AML細胞分化中UPS介導的CDK2的降解:1)確證ATRA促進CDK2通過UPS發(fā)生降解,并探討其調(diào)控機制;2)研究CDK2降解對ATRA誘導AML細胞分化的影響,并探索相關(guān)分子機制。研究方法:
　　 1)選用人白血病細胞株NB4和U937為主要研究對象,考察ATRA誘導細胞分化過程中CDK2泛素化降解的情況:細胞經(jīng)CD11b-PE抗

7、體孵育后采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面分化抗原CD11b表達;應用瑞氏.吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)學改變;應用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布;應用Real-timePCR檢測細胞中CDK2mRNA水平變化;應用’western-blot檢測CDK2及p-CDK2(Thr-160)蛋白水平變化;應用免疫熒光法檢測細胞內(nèi)CDK2與泛素蛋白(Ubiquitin,Ub)的共定位變化;采用免疫沉淀法檢測

8、CDK2與Ub的結(jié)合水平;選用COS-7細胞為瞬時表達宿主,共轉(zhuǎn)染CDK2/CDK2-T160A和Ub考察CDK2和CDK2-T160A的泛素化降解情況.采用TNT(R)兔網(wǎng)織紅細胞裂解液轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)體外表達CDK2重組蛋白。
　　 2)選用人AML細胞株NB4為主要研究對象,考察細胞內(nèi)CDK2蛋白水平下降對ATRA誘導AML細胞分化作用的影響:采用臺盼藍染色結(jié)合血細胞計數(shù)板計數(shù)觀察細胞增殖情況和細胞存活率,描繪細胞增殖曲

9、線;細胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面分化抗原CD11b表達;應用瑞氏-吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)學改變;采用硝基四氮唑藍(NBT)測試細胞還原能力;采用PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布的變化;應用western-blot檢測CDK2蛋白,細胞周期蛋白(CyclinE、CyclinA),分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(p-STAT1Try701,STAT1、PU.1、C/EBPβ)的表達情況;應用Real-timePC

10、R檢測細胞內(nèi)以上蛋白和粒性細胞特異性表達的CSF3R的mRNA表達水平。
　　 研究結(jié)果:
　　 第一部分:ATRA促進CDK2通過泛素蛋白酶體途徑降解
　　 1)藥物誘導AML細胞分化和G0/G1期阻滯過程中CDK2發(fā)生明顯下調(diào)
　　 檢測細胞分化特異性表面抗原CD11b的表達,結(jié)果顯示ATRA能夠誘導NB4和U937細胞發(fā)生髓系分化,且呈時間依賴性關(guān)系。瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果表明ATRA作用72小時后,

11、NB4細胞分化為成熟粒細胞,U937細胞分化為成熟單核/巨噬細胞。PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)的檢測發(fā)現(xiàn),ATRA能夠誘導NB4細胞和U937細胞發(fā)生時間依賴性的G0/G1期阻滯。Western-blot檢測結(jié)果顯示,ATRA作用后,NB4細胞和U937細胞中CDK2蛋白水平呈現(xiàn)逐漸下調(diào)趨勢,且與細胞的分化和周期阻滯進程高度一致。此外,在TPA和DMSO誘導NB4細胞分化和G0/G1期阻滯的過程中,CDK2蛋白水平亦發(fā)生明顯下調(diào),而采用周期同

12、步化手段使細胞分布于不同周期階段時CDK2水平則無明顯變化,進一步提示CDK2蛋白下調(diào)與ATRA誘導AML細胞分化之間的密切關(guān)系。
　　 2)AML細胞分化過程中CDK2的下調(diào)依賴于蛋白酶體通路
　　 3)CDK2在不同體系中通過泛素蛋白酶體途徑發(fā)生降解
　　 4)ATRA誘導AML細胞分化過程中促進CDK2通過UPS途徑降解
　　 5)CDK2的160位點蘇氨酸磷酸化水平對CDK2泛素化的影響
　

13、　 第二部分:CDK2降解在全反式維甲酸誘導急性髓性白血病細胞分化中的作用及機制研究
　　 1)CDK2蛋白水平的下降增強ATRA誘導AML細胞分化的作用
　　 利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將攜帶CDK2shRNA的質(zhì)粒pLKO.1-CDK2＃1shRNA和pLKO.1-CDK2＃5shRNA以及相應的質(zhì)?？蛰dpLKO.1(Vector)轉(zhuǎn)入NB4細胞,篩選并構(gòu)建穩(wěn)定表達的細胞株。Western-blot檢測結(jié)果顯示與質(zhì)粒空載相

14、比,pLKO.1-CDK2＃1shRNA的沉默CDK2表達的效率接近100％,pLKO.1-CDK2＃5shRNA的沉默效率約為60%。
　　 2)CDK2蛋白水平下調(diào)協(xié)同ATRA誘導AML細胞分化的機制研究
　　 細胞周期同步化實驗結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布的結(jié)果顯示,NB4-Vector和NB4-CDK2shRNA細胞在同步化后細胞周期G0/G1、S、G2/M的進程均無明顯差異,表明CDK2蛋白水平的下調(diào)并不影響

15、NB4細胞的周期進程。ATRA作用于NB4-Vector和NB4-CDK2shRNA細胞后不同時間檢測細胞周期分布,發(fā)現(xiàn)兩組細胞均出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯,但無論在ATRA處理前或處理后,二者的周期分布情況無顯著差異.上述結(jié)果表明,細胞內(nèi)CDK2蛋白水平的下降對NB4細胞的細胞周期無影響,同時對ATRA誘導NB4細胞G0/G1阻滯的作用亦無影響,提示CDK2蛋白下調(diào)所引起的ATRA誘導細胞分化作用的增強并非由其促進細胞周期阻滯的作用引

16、起。
　　 結(jié)論:本論文較為系統(tǒng)的探討了ATRA分化誘導治療AML過程中UPS介導的CDK2降解,并對其作用和相關(guān)機制進行了探討。首先,我們首次證實CDK2可作為UPS途徑的底物而被降解,ATRA在誘導AML細胞分化過程中促進CDK2通過UPS途徑發(fā)生降解。其次,CDK2的降解能夠促進ATRA誘導AML細胞分化的作用,且這種促進作用并非由促進細胞退出增殖周期所介導,而是通過直接調(diào)控分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的信號網(wǎng)絡而實現(xiàn)。本文闡述了CD