CDK2的泛素化降解誘導急性髓性白血病細胞分化的作用及機制研究.pdf

1、針對急性髓性白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）分化障礙的特征，全反式維甲酸（All-trans retinoic acid，ATRA）被用于誘導分化治療急性早幼粒細胞白血?。ˋcute promyelocytic leukemia，APL）獲得巨大成功。但是至今為止，腫瘤分化治療仍存在局限性，包括臨床可用藥物少和臨床適用范圍窄等。因此，尋找腫瘤細胞分化調控的新分子靶點與信號通路，并基于該靶點和信號通路研究分化

2、治療的新方法和新手段，是現(xiàn)階段分化治療藥物研究的熱點和難點問題。前期研究發(fā)現(xiàn)細胞周期依賴性激酶2（Cyclin dependent kinase2，CDK2）在急性髓性白血病細胞被誘導分化過程中發(fā)生明顯下降，且泛素蛋白酶體抑制劑MG132可以逆轉CDK2的下降過程。雖然CDK2蛋白的功能研究一直集中在細胞周期調控方面，但是多項研究結果提示CDK2可能不是細胞生長所必須的分子，并且越來越多的研究表明CDK2表達或活性下降對于細胞自我更新和

3、分化具有重要意義。以上提示我們，CDK2蛋白可能可以作為一個分化抑制因子被泛素蛋白酶體所降解，進而參與調控AML細胞分化進程。因此，我們希望研究CDK2蛋白在AML細胞分化中的蛋白下降模式及其分子調控機制，并且探索CDK2蛋白是否在急性髓性白血病細胞分化中扮演分化抑制因子的角色，對于尋找新的腫瘤分化治療策略具有積極意義。本研究分為三個部分：
　　第一部分：
　　目的：急性髓性白血病細胞分化過程中CDK2蛋白的泛素化降解及其分

4、子機制。
　　方法：采用流式細胞術結合CD11b考察AML細胞株（HL60、U937和NB4）在不同分化誘導劑作用后的分化情況;采用Western blot檢測AML細胞株被誘導分化過程中的CDK2蛋白水平變化;采用人淋巴細胞分離液從AML病人骨髓血液樣本中分離人原代AML樣本（Leu-1、Leu-2和Leu-3）;采用實時熒光定量PCR考察不同分化誘導劑作用AML細胞株后CDK2基因水平變化;采用蛋白酶體抑制劑和自噬溶酶體抑制劑

5、分別與分化誘導劑聯(lián)合使用確定CDK2蛋白的降解模式;采用免疫沉淀技術考察CDK2蛋白的泛素化修飾水平;采用賴氨酸突變?yōu)榫彼岬姆绞綄ふ褻DK2蛋白的優(yōu)先泛素化位點;采用酵母雙雜交技術尋找CDK2蛋白的特異性泛素化E3酶;采用免疫沉淀技術確證CDK2蛋白和E3酶的相互結合;采用shRNA干擾技術沉默E3酶，檢測CDK2蛋白的降解半衰期。
　　結果：⑴急性髓性白血病細胞分化過程中CDK2發(fā)生泛素化降解：CDK2在急性髓性白血病分化過程

6、中蛋白水平發(fā)生特異性下降:四種分化誘導劑(ATRA、TPA、DMSO和Dasa)在誘導AML細胞株發(fā)生分化時，CDK2蛋白發(fā)生顯著下降;ATRA誘導原代AML樣本發(fā)生分化時，CDK2蛋白發(fā)生明顯下降;ATRA在誘導骨肉瘤細胞株U2OS細胞發(fā)生分化時，CDK2蛋白水平保持相對穩(wěn)定；CDK2在急性髓性白血病細胞分化過程中的下降與基因水平調控無關:實時熒光定量PCR結果顯示，四種分化誘導劑對AML細胞株的CDK2 mRNA水平?jīng)]有顯著影響；C

7、DK2在急性髓性白血病細胞分化過程中的下降依賴于泛素蛋白酶體通路降解:AML細胞株在ATRA作用后所發(fā)生的CDK2蛋白下降可以被蛋白酶體抑制劑MG132所逆轉，但不能被自噬抑制劑3-MA和CQ所逆轉;TPA作用AML細胞株所引起的CDK2的下降同樣可以被MG132抑制。⑵急性髓性白血病細胞分化過程中CDK2泛素化降解的的分子機制：CDK2可發(fā)生多聚泛素化修飾:在COS7細胞中共表達CDK2-HA和His-Ub，免疫沉淀結果顯示CDK2可

8、以發(fā)生多聚泛素化修飾，且MG132可以進一步累積這種修飾;當Ub的48位賴氨酸被突變?yōu)榫彼岷?，CDK2的多聚泛素化修飾受到明顯抑制；CDK2泛素化降解的優(yōu)先泛素化修飾位點是129位和142位賴氨酸:當CDK2的129位和142位賴氨酸突變?yōu)榫彼岷?，蛋白合成抑制劑CHX介導的CDK2蛋白水平下調被部分逆轉，而當兩者同時突變時則可以完全抑制CDK2蛋白下降;在9個潛在泛素化位點被全突變的基礎上，只有129位或142位重新突變?yōu)橘嚢彼岷螅?/p>

9、CDK2重新發(fā)生泛素化降解；介導CDK2泛素化修飾的泛素E3連接酶是KLHL6蛋白:酵母雙雜交技術聯(lián)合E3s庫發(fā)現(xiàn)共有10個潛在的泛素化E3酶和CDK2結合，其中KLHL6可以明顯促進CDK2泛素化修飾水平;過表達KLHL6可以加快CDK2蛋白的降解速度，而沉默KLHL6則可以減慢CHX引起的CDK2蛋白水平下降速度。
　　第二部分：
　　目的：CDK2的泛素化降解對急性髓性白血病細胞分化的作用研究。
　　方法：采用s

10、hRNA干擾聯(lián)合慢病毒感染沉默AML細胞株中的CDK2蛋白;采用細胞計數(shù)和臺盼藍拒染法考察CDK2沉默后對AML細胞的增殖和存活的影響;采用細胞表面抗原CD11b表達水平、對NBT的還原能力和細胞核形態(tài)變化檢測CDK2沉默后對AML細胞分化的作用;采用同義突變進行CDK2蛋白在shRNA基礎上重新過表達;采用CDK2小分子抑制劑抑制CDK2的激酶活性，并考察其對AML細胞的誘導分化作用;采用PI單染結合流式細胞術考察CDK2抑制劑對AM

11、L細胞的死亡誘導情況;采用裸小鼠腋下接種AML細胞，并瘤內注射shCDK2慢病毒，通過檢測腫瘤體積和瘤內細胞的CD11b表達水平檢測CDK2對AML腫瘤生長影響;采用NOD-SCID小鼠尾靜脈注射shCDK2慢病毒感染的AML細胞，流式檢測hCD45/mCD45水平或者血涂片染色考察NOD-SCID AML小鼠的外周血液中的AML細胞的浸潤情況，并定期檢測CDK2對AML小鼠的生存時間的影響。
　　結果：⑴CDK2蛋白水平下降對急

12、性髓性白血病細胞分化的作用研究：沉默CDK2對急性髓性白血病細胞增殖的影響:采用shRNA聯(lián)合慢病毒感染沉默AML細胞株中的CDK2蛋白，shCDK2＃2效果最好，shCDK2＃3次之，shCDK2＃1相對較弱;三個shCDK2均可以明顯抑制AML細胞的增殖，且shCDK2＃2效果最強，shCDK2＃3次之，shCDK2＃1相對較弱；沉默CDK2對急性髓性白血病細胞分化的影響:三個shCDK2均可以明顯上調CD11b的表達（從對照組的5

13、.39±1.59％分別上升到33.7±0.18％、55.0±6.09％和40.7±2.54％）;三個shCDK2均可以增強細胞NBT還原能力;shCDK2組的AML細胞核多呈現(xiàn)半月形，同時核質比明顯減少;shCDK1和shCDK2均可以明顯抑制AML細胞的增殖，但只有shCDK2可以明顯促進AML細胞分化；沉默CDK2對急性髓性白血病病人臨床樣本的誘導分化作用:shCDK2＃2感染的原代樣本的CD11b表達水平明顯上調，細胞核形態(tài)發(fā)生明

14、顯變化以及細胞分化相關轉錄因子STAT1、PU.1和CEBPβ均發(fā)生明顯上調。⑵CDK2的激酶活性抑制對急性髓性白血病細胞分化的影響：CDK2顯性失活突變體D145N參與調控AML細胞分化進程:細胞分化表面標志物CD11b和瑞氏吉姆薩染色結果均顯示，在shCDK2＃2促進AML細胞株發(fā)生分化的基礎上，重新過表達HA-CDK2(CM14)可以抑制這一效應，而HA-D145N(CM14)則沒有類似的逆轉shCDK2介導的分化效果；CDK2小

15、分子抑制劑誘導AML細胞發(fā)生分化:三個CDK2抑制劑（SU9516、CVT313和Nu6102）在不會導致AML細胞株發(fā)生明顯的死亡的基礎上，可以促使AML細胞的CD11b表達升高，NBT還原能力顯著增強。⑶抑制CDK2誘導急性髓性白血病細胞分化的體內抗腫瘤活性研究：CDK2下降通過誘導AML細胞分化抑制裸鼠腋下移植瘤生長:Scramble組的瘤體積不斷增長，而shCDK2組腫瘤增長明顯受到抑制（在實驗結束時，對照組瘤體積為2539±3

16、86mm3，shCDK2組為969±188mm3）;shCDK2組的瘤內細胞CDK2水平相較于Scramble組發(fā)生明顯下降;與Scramble組相比，shCDK2組的CD11b表達水平顯著增加；CDK2下降通過誘導AML細胞分化延長NOD-SCID白血病小鼠生存時間:Scramble組的小鼠血液中hCD45+mCD45的比例隨著時間的延長明顯增加（在第32天、第38天和第40天分別為2.04±0.92％、6.91±3.47％和24.8

17、5±8.03％），而shCDK2組血液中的hCD45+mCD45-的比例一直保持在較低狀態(tài)（在第32天、第38天和第40天分別為1.08±0.53％、1.71±1.33％和1.34±1.16％）;血涂片結果同樣顯示Scramble組的小鼠血液中存在較高比例的人源性HL60細胞，而shCDK2組則檢測不到;Scramble組的5只小鼠分別在第41、43、43、44和44天死亡，而相對應的shCDK2組的小鼠沒有發(fā)生明顯的死亡情況。

18、　　第三部分：
　　目的：CDK2的泛素化降解調控急性髓性白血病細胞分化的分子機制探索。
　　方法：采用實時熒光定量PCR技術考察CDK2沉默后分化相關因子的mRNA水平;采用基因芯片考察抑制CDK2誘導分化過程中AML細胞的基因表達情況;采用Cluster程序對差異性基因進行分層聚類分析;采用shRNA聯(lián)合慢病毒感染技術沉默AML細胞中MAFB的表達;采用冰凍切片聯(lián)合免疫熒光技術考察裸鼠腋下腫瘤中MAFB和CDK2的蛋白水

19、平;采用Western blot技術檢測CDK2沉默誘導AML細胞分化過程中PML/RARα的降解情況;采用RARE熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測shCDK2對RARα轉錄活性的影響;采用免疫沉淀富集CDK2蛋白并聯(lián)合LC/MS/MS技術尋找與CDK2相互作用的蛋白;采用DCFDA探針檢測shCDK2誘導AML細胞分化過程中細胞內H2O2的水平變化;采用免疫沉淀技術確證CDK2蛋白與過氧化物酶家族PRDXs蛋白的結合情況;采用Western

20、blot技術檢測下調CDK2介導的AML細胞分化過程中PRDXs的蛋白水平;采用大腸桿菌原核系統(tǒng)體外純化CDK2和PRDX2重組蛋白;采用經(jīng)典的TRX/TRXR/NADPH偶聯(lián)PRDX酶活體系檢測體外PRDX的過氧化物酶活性;采用shRNA技術聯(lián)合慢病毒感染沉默AML細胞中的PRDX2水平，并結合CDl1b表達、NBT還原能力和核形態(tài)檢測AML細胞的分化水平。
　　結果：⑴CDK2泛素化降解調控分化的下游網(wǎng)絡及其關鍵因子尋找:①沉

21、默CDK2誘導急性髓性白血病細胞分化過程的基因表達譜分析:采用人基因表達譜芯片Affymetrix U133 Plus2.0分析發(fā)現(xiàn)，在第2天和第5天中分別有35（其中18個上調，17個下調）和499（其中473個上調，26個下調）個基因呈現(xiàn)出顯著性變化，而其中有16個基因在兩個時間點的三個shCDK2組中都發(fā)生明顯上調;②MAFB在CDK2調控急性髓性白血病細胞分化過程中的關鍵作用:在這16個基因中，MAFB的上調倍數(shù)最為明顯（在三組

22、shCDK2中分別上調151、64和252倍）;在CDK2沉默的AML細胞株中，MAFB的蛋白表達發(fā)生上調;在腋下瘤組織中，shCDK2組的MAFB的蛋白表達也呈現(xiàn)上調趨勢;shMAFB＃1和shMAFB＃2均可以明顯的抑制第2天和第5天時shCDK2介導的CD11b上調和NBT還原能力的增加。⑵CDK2調控急性髓性白血病細胞分化的直接作用靶點及分子機制尋找：CDK2下降誘導分化過程中對PML/RARα及RARα的影響:shCDK2不能

23、降解PML/RARα，且對RARα蛋白水平?jīng)]有影響;RARE熒光素酶報告基因系統(tǒng)結果表明，shCDK2不能促進RARα轉錄活性的增加；H2O2在CDK2抑制誘導AML細胞分化過程中發(fā)揮重要作用:相較于Scramble組，shCDK2＃2組的AML細胞呈現(xiàn)明顯的H2O2累積現(xiàn)象;H2O2清除劑NAC可以明顯的抑制shCDK2介導的CD11b表達水平的上調和NBT還原能力的增加；CDK2通過直接作用PRDX2調控急性髓性白血病細胞分化過程:

24、LC/MS/MS檢測結果顯示，共有68個蛋白被富集到CDK2蛋白上，其中包括了兩個PRDXs家族成員（PRDX1和PRDX2）；在AML細胞株中PRDX1和PRDX2均表達，但是只有PRDX2和CDK2相互作用;shCDK2不影響AML細胞中PRDX2的蛋白表達水平;體外酶活實驗結果顯示，CDK2可以顯著促進PRDX2對NADPH的消耗能力;shPRDX2可以介導AML細胞的CD11b表達水平發(fā)生上調、NBT還原能力顯著增加，以及核形態(tài)

25、呈現(xiàn)半月形或馬蹄形等粒性成熟特征。
　　結論：研究發(fā)現(xiàn)在急性髓性白血病細胞被誘導分化過程中CDK2蛋白發(fā)生了KLHL6介導的特異性泛素蛋白酶體降解;而進一步研究則顯示基因沉默或采用小分子化合物抑制CDK2均可以誘導急性髓性白血病細胞退出分化阻滯，進而抑制腫瘤體積的增長，延長AML白血病小鼠的生存時間;基因表達譜分析和質譜檢測結果揭示CDK2可能是通過靶向PRDX2促進其過氧化物酶的活性，進而導致細胞內H2O2的下降，抑制下游分化通