KiSS-1-GPR54系統(tǒng)在雄性大鼠生殖軸系功能研究.pdf

1、背景： 在個體發(fā)育過程中，下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸系在這一復(fù)雜生理過程中起著主導(dǎo)作用。HGP軸系是男女兩性獲得正常生殖功能的基礎(chǔ)。下丘腦GnRH規(guī)律脈沖釋放是青春期啟動的標(biāo)志。有許多神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)參與GnRH的調(diào)控，NMDA、NO、leptin等對GnRH有正調(diào)作用，而NPY和GABA等具有負(fù)調(diào)控作用。同時GnRH的轉(zhuǎn)錄還受到性腺類固醇激素的負(fù)反饋調(diào)控。KiSS-1是在哺乳動物新發(fā)現(xiàn)的參與GnRH調(diào)控的基因，GPR54是

2、KiSS-1編碼產(chǎn)物的受體。GPR54受體突變的個體可以發(fā)生原發(fā)性低促性腺激素性性腺功能低下(IHH)，KiSS-1和GPR54可能與青春期啟動密切相關(guān)。KiSS-1和GPR54在生殖調(diào)控中的功能和機(jī)制研究相對較少，對其研究可以完善我們對于青春期啟動和生殖調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識，為生殖調(diào)控和異常疾病的治療尋找新的靶點。 目的： 1．下丘腦是生殖內(nèi)分泌調(diào)控的中樞。利用分子生物學(xué)的方法，檢測大鼠下丘腦的KiSS-1的表達(dá)，評價其對G

3、nRH神經(jīng)元的促進(jìn)作用。 2．進(jìn)一步探討KiSS-1調(diào)控GnRH可能的機(jī)制，從而在機(jī)制上解釋KiSS-1和GPR54與發(fā)育的關(guān)系。 3．檢測大鼠睪丸中KiSS-1和GPR54的表達(dá)，分析其在性腺可能的直接的作用，從而探討KiSS-1和GPR54在整個下丘腦-垂體-性腺軸系的功能。 方法： 1．觀察不同發(fā)育階段雄性大鼠下丘腦KiSS-1、GPR54和GnRHmRNA表達(dá)，探討KiSS-1在性發(fā)育的啟動和正常

4、生殖功能調(diào)節(jié)中的作用。檢測雄性大鼠kisspeptin腦室注射后，化學(xué)發(fā)光法檢測血清中睪酮的變化。 2．成年雄性大鼠腦室注射kisspeptin后，用RT-PCR和定量PCR等方法，檢測下丘腦GnRH mRNA的表達(dá)及垂體FSH-β和LH-βmRNA表達(dá)變化。 3．雄性去勢青春期大鼠腹腔注射40mg/BW NMDA或1mg/BWMK-801，與鹽水注射大鼠對照，比較下丘腦KiSS-1 mRNA表達(dá)。 4．免疫組化

5、方法檢測不同發(fā)育階段雄性大鼠睪丸中KiSS-1和GPR54的表達(dá)。 5．統(tǒng)計學(xué)方法：將上述檢測指標(biāo)運用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。 結(jié)果： 1．從RT-PCR結(jié)果表明隨發(fā)育過程大鼠下丘腦的KiSS-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，到性發(fā)育期水平最高，成年期略下降，但保持相對較高水平。未發(fā)育期、發(fā)育早期、性發(fā)育期和性成熟期大鼠KiSS-1 mRNA水平分別是幼年時的1.7、2.1、3.5、2.0倍。從rea

6、l-timePCR結(jié)果對GnRH和KiSS-1轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)分析顯示，在發(fā)育過程中，GnRH與KiSS-1表達(dá)變化正相關(guān)，GnRH神經(jīng)原轉(zhuǎn)錄激活晚于KiSS-1。GnRH在性發(fā)育期轉(zhuǎn)錄水平最高，未發(fā)育期、發(fā)育早期、性發(fā)育期和性成熟期表達(dá)水平分別是幼年時的1.1、1.9、2.4、1.9倍。GPR54在發(fā)育各階段都有表達(dá)，幼年期和未發(fā)育期基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于性發(fā)育期和性成熟期。 2．大鼠側(cè)腦室注射(icv)1nmol kisspep

7、tin后，未檢測到GnRH mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，垂體FSH-β和LH-β mRNA水平顯著升高。Kisspeptin注射2h后，大鼠血清睪酮水平顯著升高。 3．與生理鹽水對照組相比，NMDA腹腔注射后，下丘腦KiSS-1mRNA表達(dá)下降；而MK-801注射后，KiSS-1基因轉(zhuǎn)錄水平升高。 4．免疫組化示睪丸中有KiSS-1和GPRL54的表達(dá)，免疫反應(yīng)性都定位于生精細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞無表達(dá)。在性發(fā)育期睪丸KiSS-1和G

8、PR54表達(dá)最高，未發(fā)育期表達(dá)最低。 結(jié)論： 1．KiSS-1及其受體GPR54是調(diào)控性腺軸系功能的因素之一，雖然本文未發(fā)現(xiàn)KiSS-1顯著影響GnRH基因轉(zhuǎn)錄水平，但kisspeptin可能顯著促進(jìn)GnRH蛋白(10肽)水平的表達(dá)與釋放，表現(xiàn)為LH和FSH表達(dá)增加，外周血睪酮水平升高。 2．KiSS-1表達(dá)與GnRH表達(dá)具有正相關(guān)性，其可能參與GnRH的調(diào)控，與性發(fā)育啟動和生殖功能調(diào)控有關(guān)。KiSS-1及GPR

9、54的表達(dá)與性發(fā)育相關(guān)，在發(fā)育期表達(dá)最高，因此與性發(fā)育啟動有關(guān)。 3．興奮性氨基酸可以直接或間接的調(diào)控KiSS-1基因轉(zhuǎn)錄活動。 NMDA對KiSS-1具有負(fù)調(diào)作用，其非競爭性受體拮抗劑可以上調(diào)KiSS-1表達(dá)。表明KiSS-1位于NMDA的下游，可能介導(dǎo)NMDA等其他調(diào)控因子對GnRH的調(diào)控作用。 4．KiSS-1及其受體GPR54在睪丸中生精細(xì)胞表達(dá)，可能調(diào)控生精細(xì)胞的成熟過程。表明KiSS-1和GPR54