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文檔簡介
1、我國為傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國,農(nóng)作物種類多,且分布廣。農(nóng)作物所遭受到的生物災(zāi)害復(fù)雜多樣,危害嚴(yán)重,如鼠害的發(fā)生已對農(nóng)牧業(yè)發(fā)展以及人類生活健康造成了嚴(yán)重威脅。因此,要想從根源上治理鼠害,需使用有效的分子生物學(xué)或生態(tài)平衡等措施,更便捷、更具有針對性的防治鼠害。黑線倉鼠(Cricetulus barabensis)是我國華北地區(qū)典型的害鼠之一,其繁殖方式具有伴隨季節(jié)周期性轉(zhuǎn)變的特點(diǎn),實(shí)驗(yàn)以黑線倉鼠為研究對象,既是研究哺乳動物季節(jié)性繁殖的良好材料,又為
2、治理鼠害提供理論依據(jù)。本研究以分子生物學(xué)方法和技術(shù),研究與繁殖相關(guān)的中樞調(diào)控基因KiSS-1及其受體GPR54的表達(dá)模式,以揭示KiSS-1/GPR54調(diào)控通路在連接光照等季節(jié)性因素和繁殖機(jī)制中所起到的主要作用。
首先,采用RT-PCR方法克隆黑線倉鼠GPR54基因全部cDNA序列,進(jìn)行生物信息學(xué)分析,對與其配體KiSS-1的相互作用方式進(jìn)行探究,以便通過兩者的結(jié)合作用模式了解KiSS-1/GPR54調(diào)控通路的功能位點(diǎn)??寺~@
3、得黑線倉鼠GPR54基因序列1102bp,其中包括全部編碼區(qū)序列939bp(GenBank登錄號:KF006323)。對GPR54基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行分析可知,翻譯共獲得213個氨基酸,對二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明整體疏水性較強(qiáng)。將所獲得的GPR54氨基酸序列與小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)等相應(yīng)序列相比對,發(fā)現(xiàn)存在240bp左右的片段缺失,使用Pred
4、ictProtein工具預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu),僅能預(yù)測出黑線倉鼠GPR54氨基酸序列的6次跨膜結(jié)構(gòu),不具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體7次跨膜,推測可能是由于缺失片段造成了跨膜區(qū)域的中斷,并與其配體KiSS-1的特異性識別位點(diǎn)結(jié)合有關(guān)。使用MEGA5.0軟件對所獲得的GPR54 mRNA序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,所獲結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)果一致。
其次,檢測外源褪黑激素對黑線倉鼠中樞神經(jīng)和外周性腺KiSS-1/GPR54系統(tǒng)以及GnRH的表達(dá)模式,驗(yàn)
5、證KiSS-1/GPR54系統(tǒng)在生殖活動中起到的作用。本研究采用外源褪黑激素注射(15天)的方式,且注射期間對黑線倉鼠的體重進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。雌雄處理組的體重在進(jìn)行褪黑激素注射后分別于第9日和第12日開始顯著低于對照組。處死后對臟器系數(shù)進(jìn)行檢測,對照組與處理組黑線倉鼠的副性器官(子宮、附睪)具有顯著差異(p<0.05),而性腺系數(shù)差異不顯著(p>0.05)。隨后通過實(shí)時熒光定量PCR方法,對黑線倉鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周性腺KiSS-1、GP
6、R54 mRN A的表達(dá)差異進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示:處理組下丘腦中KiSS-1基因表達(dá)量顯著低于對照組(p<0.05),雌雄黑線倉鼠的性腺KiSS-1及其受體GPR54表達(dá)量也具有顯著性差異(p<0.05),提示褪黑激素可能通過對KiSS-1/GPR54系統(tǒng)的抑制從而進(jìn)一步抑制黑線倉鼠的繁殖活性,此系統(tǒng)可能是介導(dǎo)光照和黑線倉鼠繁殖的重要調(diào)控通路。對下丘腦GnRH的表達(dá)模式進(jìn)行檢測表明,對照組與處理組的GnRH的表達(dá)量也存在顯著差異(p<0
7、.05),且均于下丘腦KiSS-1 mRNA表達(dá)趨勢相一致。推測,KiSS-1、GPR54以及GnRH都是作用于下丘腦-垂體-性腺軸進(jìn)而調(diào)控繁殖活性的重要因子。
最后,對自然季節(jié)黑線倉鼠KiSS-1、GPR54基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測,并使用激素含量檢測和實(shí)時熒光定量兩種方式,驗(yàn)證了黑線倉鼠KiSS-1/GPR54系統(tǒng)對繁殖活動的季節(jié)性調(diào)控及生殖發(fā)育的作用。其中,對血清中褪黑激素和Kisspeptin的含量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)光周期作為
8、調(diào)節(jié)因子發(fā)揮了重要作用。對中樞神經(jīng)下丘腦KiSS-1基因的表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)雌雄黑線倉鼠均為夏季表達(dá)量最高,GPR54的表達(dá)則有性別差異,雌性為冬季顯著低于其他三個季節(jié)(p<0.05),雄性則表現(xiàn)為夏季顯著性低表達(dá)(p<0.05)。對外周性腺檢測發(fā)現(xiàn),卵巢KiSS-1和GPR54表達(dá)量均呈現(xiàn)出春季顯著高表達(dá)(p<0.05),睪丸中則呈現(xiàn)了不同的表達(dá)模式,即春、秋季節(jié)KiSS-1表達(dá)量顯著高于夏、冬季(p<0.05),而GPR54的表達(dá)量為春
9、、秋季低于夏、冬季,表現(xiàn)一種對其配體KiSS-1代償性的增加。綜合推斷,下丘腦的表達(dá)模式可能更趨向于受到外界環(huán)境因子調(diào)控,性腺的表達(dá)則更多的與黑線倉鼠的繁殖活動的季節(jié)循環(huán)周期相一致,而雌雄性腺KiSS-1 mRNA所呈現(xiàn)的不同的表達(dá)模式,推測是由于下丘腦不同核區(qū)對性激素的正負(fù)反饋機(jī)制存在性別差異,使中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出的不同信號對機(jī)體的繁殖調(diào)控產(chǎn)生了雌雄表達(dá)模式差異。
綜上所述,本研究通過自然季節(jié)取樣和褪黑激素處理兩種方法證實(shí)了K
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