高脂肥胖對(duì)雌性大鼠排卵功能及卵巢kisspeptin-GPR54系統(tǒng)的影響.pdf

1、隨著肥胖發(fā)生率的持續(xù)升高，肥胖已經(jīng)成為一個(gè)不可忽視的公共衛(wèi)生問(wèn)題。機(jī)體的能量平衡與生殖功能密切相關(guān)，過(guò)多的能量攝入常常會(huì)導(dǎo)致人體的生育力下降。肥胖的女性往往會(huì)出現(xiàn)排卵失調(diào)、月經(jīng)紊亂等癥狀。同時(shí)，肥胖對(duì)受孕、受精卵種植、胚胎發(fā)育也有不利影響。然而，肥胖是通過(guò)何種機(jī)制影響生殖功能的到目前為止尚不明確。
　　Kisspeptin蛋白是包括多種結(jié)構(gòu)相近的多肽在內(nèi)的蛋白家族，由Kiss1基因編碼，并與G蛋白耦聯(lián)受體54(GPR54)結(jié)合，后

2、者由Kiss1r基因編碼。Kisspeptin/GPR54系統(tǒng)在多個(gè)物種的卵巢中表達(dá)，并且呈時(shí)間與空間特異性。卵巢Kiss1基因的表達(dá)量在動(dòng)情前期的傍晚出現(xiàn)峰性升高，提示kisspeptin在卵巢排卵過(guò)程發(fā)揮局部調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明kisspeptin蛋白可能是連接能量平衡和生殖功能的橋梁。雖然卵巢kisspeptin/GPR54系統(tǒng)具有直接調(diào)節(jié)卵巢功能的潛在功能，目前尚不清楚卵巢kisspeptin/GPR54是否與肥

3、胖導(dǎo)致的生殖功能損傷有關(guān)，尤其是排卵功能。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建飲食誘導(dǎo)肥胖模型，觀察高脂肥胖對(duì)卵巢kisspeptin/GPR54系統(tǒng)表達(dá)，以及排卵功能的影響，探討卵巢kisspeptin/GPR54系統(tǒng)在卵巢功能中可能發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　雌性Sprague-Dawley孕鼠分別置于獨(dú)立的籠子中飼養(yǎng)。在生產(chǎn)的當(dāng)天(postnatal day0，PND0)，將幼鼠稱(chēng)重、區(qū)分性別。在PND1將每

4、籠幼鼠的數(shù)目調(diào)整為12只，直到PND21斷奶。在PND21將雌鼠隨機(jī)分配至高脂(HFD)組和正常(NCD)組，分別給予40％脂肪含量的高脂飼料和5％脂肪含量的正常飼料，以形成高脂肥胖動(dòng)物模型(HFD)和正常對(duì)照組(NCD)。將HFD、NCD雌鼠再次分為青春期前組、青春期組和成年組，分別喂養(yǎng)到PND30、PND42和PND70。所有雌鼠于生后1周開(kāi)始每周測(cè)定體重。從PND28開(kāi)始每天觀測(cè)雌鼠陰道口的開(kāi)放情況。一旦陰道口開(kāi)放，即在每天早晨8

5、點(diǎn)取陰道涂片，判斷卵巢周期是否規(guī)律。自陰道口開(kāi)放后連續(xù)觀察2周，并于第8-9周成年后重復(fù)2周。當(dāng)各組喂養(yǎng)達(dá)到目標(biāo)天數(shù)時(shí)，在下午5點(diǎn)以10％水合氯醛麻醉（3mg/100g，腹腔注射），行陰道涂片確定當(dāng)時(shí)的動(dòng)情周期，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。一側(cè)卵巢立即保存于-80℃冰箱中待RNA測(cè)定;另一側(cè)卵巢固定于4％多聚甲醛，用于后續(xù)免疫化學(xué)染色。熒光定量PCR法測(cè)定Kiss1、Kiss1RmRNA，以及排卵相關(guān)基因GDF9、BMP15FSHR、PTGS2

6、mRNA的表達(dá)水平。免疫組化法測(cè)定kisspeptin、GPR54蛋白的在卵巢的表達(dá)部位及強(qiáng)度。
　　結(jié)果:
　　在飲食干預(yù)前，HFD組和NCD組的體重?zé)o明顯差異(HFD:48.3±0.3g vs NCD:47.8±0.9g; P＞0.05)。在青春期(PND42)，HFD組雌鼠的體重明顯高于NCD組(HFD:179.4±4.0 g vs NCD:160.2±6.7g; P＜0.05)。同樣，在成年期(PND70) HFD組

7、雌鼠的體重顯著高于NCD(HFD:268.7±6.4g vs NCD:234.0±2.8g;P＜0.05)。高脂飲食對(duì)雌鼠的的青春期發(fā)育也有顯著影響，HFD組雌鼠陰道口開(kāi)放時(shí)間較NCD組明顯提前(HFD:31.8±0.3d vs NCD:35.4±0.3d; P＜0.05)。
　　在青春期，NCD組中絕大多數(shù)(83.3％)的雌鼠有正常卵巢周期，而HFD組只有38.9％的雌鼠有正常卵巢周期，結(jié)果有顯著差異(P＜0.05)。在成年期，

8、NCD中77.8％的雌鼠有正常卵巢周期，而HFD組只有27.8％的雌鼠有正常卵巢周期，結(jié)果呈顯著差異(P＜0.05)。在雌鼠動(dòng)情前期的傍晚，測(cè)定青春期和成年期雌鼠卵巢的GDF9、FSHR、PTGS2 mRNA水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，HFD組上述基因mRNA的表達(dá)量較NCD組均呈顯著降低(P＜0.05);而HFD組BMP15mRNA的表達(dá)水平僅在青春期時(shí)顯著降低(P＜0.05)。
　　在青春期前，HFD組和NCD組卵巢Kiss1/Kiss1r

9、mRNA的表達(dá)水平均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。在青春期雌鼠中，HFD組動(dòng)情前期和動(dòng)情期的卵巢Kiss1 mRNA的表達(dá)量較NCD組明顯減少(P＜0.05);在成年期，HFD組動(dòng)情前期、動(dòng)情期和動(dòng)情后期的卵巢Kiss1 mRNA表達(dá)量同樣較NCD組顯著較少(P＜0.05)。然而，不論是青春期還是成年期，卵巢Kisslr mRNA的表達(dá)水平在HFD組和NCD組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　青春期和成年期時(shí)，在HFD組處于動(dòng)情

10、前期、動(dòng)情期的竇狀卵泡卵泡膜細(xì)胞中，kisspeptin蛋白的免疫組化染色強(qiáng)度（平均光密度值）均較NCD組明顯降低(P＜0.05);另外在青春期和成年期，HFD組處于動(dòng)情前期的排卵前卵泡卵泡膜細(xì)胞中，kisspeptin的免疫組化染色強(qiáng)度也較NCD組明顯降低(P＜0.05);然而，GPR54蛋白的染色強(qiáng)度在竇狀卵泡和排卵前卵泡中較NCD組均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　本研究表明，生命早期高脂肥胖對(duì)大鼠生殖功