芥菜開花整合子AGL24與SVP、FLC、SOC1互作分析及作用位點(diǎn)的鑒定.pdf

1、芥菜開花時(shí)間的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜精細(xì)的過程，需要整合環(huán)境信號(hào)以及植物體內(nèi)信號(hào)，在適宜的環(huán)境以及生理?xiàng)l件下才可以進(jìn)行開花轉(zhuǎn)換，植物進(jìn)而可以由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在這個(gè)開花過程發(fā)揮的作用至關(guān)重要，并且在開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著許多關(guān)鍵性的位置。其中FLC和SVP作為開花抑制因子，而SOC1和AGL24能夠促進(jìn)開花。AGL24、SOC1、SVP、FLC編碼的蛋白均屬于MIKC型蛋白，在調(diào)控開花網(wǎng)絡(luò)中它們是通過蛋白互作來行使其

2、功能的。而蛋白之間的相互作用對(duì)蛋白本身的功能以及它們所調(diào)控的生物進(jìn)程也至關(guān)重要。芥菜中大多數(shù)的MADS結(jié)構(gòu)域蛋白間的相互作用都保守，截止目前，有關(guān)SVP、SOC1、FLC的功能和作用機(jī)制已有較多研究，但是AGL24的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。為了研究AGL24與這些同類蛋白在植物體內(nèi)是否產(chǎn)生相互作用，并篩選出蛋白互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)利用了酵母雙雜交系統(tǒng)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)。研究AGL24蛋白與其他蛋白之間的相互作用，可以進(jìn)一步的揭示分子

3、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中潛在的功能聯(lián)系，同時(shí)也為生物體內(nèi)的生物進(jìn)程在分子水平上作進(jìn)一步的解釋。
　　主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.芥菜AGL24基因亞克隆及生物信息學(xué)分析
　　以芥菜莖尖總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增得到的AGL24基因的cDNA序列為666 bp，編碼221個(gè)氨基酸殘基，屬于MIKC型蛋白，與油菜的AGL24親緣關(guān)系最近，與毛白楊的相對(duì)最遠(yuǎn)。AGL24蛋白主要呈現(xiàn)親水性，其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明芥菜AGL24

4、蛋白α螺旋占50％，且主要集中在K域，β折疊和卷曲螺旋分別占12％和38％。本試驗(yàn)預(yù)測(cè)得到了AGL24蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖。
　　2.芥菜AGL24與SVP、FLC相互作用檢測(cè)
　　構(gòu)建酵母誘餌表達(dá)載體pGADT7-AGL24以及AGL24去M域的重組質(zhì)粒pGADT7-AGL24M，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母中得到酵母轉(zhuǎn)化子Y187(pGBKT7-AGL24)和Y187(pGBKT7-AGL24M)，經(jīng)過毒性及自

5、激活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無自激活和毒性現(xiàn)象。將Y187(pGBKT7-AGL24)和Y187(pGBKT7-AGL24M)分別與本實(shí)驗(yàn)室提供的 Y2HGold(pGBKT7-SVP)、 Y2HGold(pGBKT7-SVP)融合后，二倍體酵母Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-SVP)、 Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-SVP)、Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGo

6、ld(pGBKT7-FLC)、Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-FLC)均不能在選擇型培養(yǎng)基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA(QDO/X/A)平板上生長。
　　將AGL24及AGL24去M域截短體與BiFC中的C端載體（pSPYCE-35S）重組構(gòu)建重組質(zhì)粒YCEG和YCEGM，將SVP和FLC分別與BiFC的N端載體（pSPYNE-35S）重組構(gòu)建重組質(zhì)粒Y

7、NES和YNEF，通過冷熱刺激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。將含YCEG和YCEGM的農(nóng)桿菌分別與含YNES和YNEF的農(nóng)桿菌菌液等量混合共浸潤4～6片真葉的本氏煙，48 h后通過激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)光下觀察，發(fā)現(xiàn)YCEG×YNES、YCEG×YNEF、 YCEGM×YNES、YCEGM×YNEF在本氏煙草表皮細(xì)胞上無黃色熒光發(fā)出。說明了開花信號(hào)整合子AGL24及AGL24去M域截短體與開花負(fù)調(diào)控因子SVP、FLC均沒有產(chǎn)生蛋

8、白相互作用。
　　3.芥菜AGL24與SOC1相互作用檢測(cè)
　　將Y187(pGADT7-AGL24)、Y187(pGADT7-AGL24M)分別與Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y2HGold(pGBKT7-SOC1M)融合后，二倍體酵母Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1M)均能在選擇型培養(yǎng)

9、基SD/-Leu/-Trp/AbA(DD O/A)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)平板上長白色菌落、并能在QDO/X/A平板上生長呈現(xiàn)藍(lán)色菌斑，而二倍體酵母Y187(pGADT7-AGL24M)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y187(pGADT7-AGL24)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1 M)經(jīng)多次鑒定表明不能在DDO/A、QDO、QDO/X/A上生長。
　　利用Thermo公司Y

10、eastβ-Galactosidase Assay Kit試劑盒測(cè)定雜交組合pGADT7-AGL24×pGBKT7-SOC1和pGADT7-AGL24M×pGBKT7-SOC1M的β-半乳糖苷酶活性來分析蛋白作用強(qiáng)度。發(fā)現(xiàn)全長蛋白AGL24與SOC1互作的平均酶活性(5.05 Miller Units)顯著低于截短體AGL24M與SOC1M之間的活性(8.24 Miller Units)，說明芥菜AGL24和SOC1蛋白的M域?qū)Φ鞍谆プ?/p>

11、具有一定抑制作用。
　　將SOC1及SOC1去M域截短體與BiFC的N端載體(pSPYNE-35S)重組構(gòu)建重組質(zhì)粒YNEO和YNEOM。將含YCEG和YCEGM的農(nóng)桿菌分別與含YNEO和YNEOM的農(nóng)桿菌菌液等量混合共浸潤4～6片真葉的本氏煙，48 h后通過激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)光下觀察發(fā)現(xiàn)，共浸潤含YCEG和YNEO、YCEGM和YNEOM的本氏煙草表皮細(xì)胞發(fā)出黃色熒光，而共浸潤含YCEGM和YNEO、YCEG和Y

12、NEOM的本氏煙草表皮細(xì)胞不發(fā)光。綜上說明，開花信號(hào)整合子AGL24與SOC1及其兩蛋白均去掉M域的截短體存在相互作用，但兩蛋白中有且僅有其中一蛋白M域存在的情況下沒有蛋白互作。
　　4.芥菜AGL24突變體的構(gòu)建及其與SOC1作用位點(diǎn)的篩選
　　在AGL24蛋白的K域預(yù)測(cè)了三個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)，并分別構(gòu)建AGL24Q107L、AGL24R137L、AGL24E169L3個(gè)AGL24突變體，并構(gòu)建 pGADT7-AGL24

13、Q107L、pGADT7-AGL24R137L，pGADT7-AGL24E169L突變體酵母表達(dá)載體。通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母中得到酵母轉(zhuǎn)化子Y187的Y187（pGADT7-AGL24Q107L）、Y187(pGADT7-AGL24R137L)和Y187(pGADT7-AGL24E169L)。經(jīng)過毒性及自激活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均無自激活和毒性現(xiàn)象。分別將這3個(gè)突變體的酵母轉(zhuǎn)化子與Y2HGold(pGBKT7-SOC1)融合，

14、發(fā)現(xiàn)二倍體酵母Y187(pGADT7-AGL24R137L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)、Y187(pGADT7-AGL24E169L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)能在選擇型培養(yǎng)基QDO/X/A平板上長藍(lán)色菌落，而Y187(pGADT7-AGL24 Q107L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)不能生長。
　　酵母β-半乳糖苷酶活性分析表明:在與SOC1蛋白相互作用中，第137和169位點(diǎn)的AG

15、L24突變體（AGL24R137L和AGL24E169L）與與非突變體AGL24差異不顯著，它們的酶活分別為3.11，3.70和4.44，說明第137和169位點(diǎn)不是調(diào)節(jié)SOC1與AGL24之間作用強(qiáng)度的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　將AGL24三個(gè)突變體與BiFC中的C端載體(pSPYCE-35S)重組構(gòu)建重組質(zhì)粒YCEGQ107L、YCEGR137L、YCEGE169，與SOC1連BiFC的N端載體(pSPYNE-35S)構(gòu)建重組質(zhì)粒YNE

16、O，通過冷熱刺激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。將分別含YCEG Q107L、YCEGR137L、YCEGE169的農(nóng)桿菌與含YNEO的農(nóng)桿菌菌液等量混合共浸潤4～6片真葉的本氏煙，48 h后通過激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)光下觀察，發(fā)現(xiàn)混合組合YCEGR137L×YNEO、YCEGE169L×YNEO有黃色熒光產(chǎn)生，混合組合YCEGQ107L×YNEO沒有熒光發(fā)出。綜上說明，開花信號(hào)整合子AGL24的第137位和169位氨基酸突變后對(duì)

17、蛋白相互作用沒有產(chǎn)生明顯的抑制作用，而第107位氨基酸突變后抑制了AGL24與SOC1蛋白的互作，說明第107位氨基酸時(shí)參與蛋白互作的關(guān)鍵氨基酸。
　　5.芥菜SOC1突變體與AGL24作用位點(diǎn)的篩選
　　通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將本實(shí)驗(yàn)室提供的SOC1突變體酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-SOC1 V77K、pGBKT7-SOC1P81K、pGBKT7-SOC1 K108V、pGBKT7-SOC1 R109L以及pGBKT7-SOC1

18、C137K轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母中得到酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGold(pGBKT7-SOC1V77K)，Y2HGold(pGBKT7-SOC1 P81K)，Y2HGold(pGBKT7-SOC1K108V), Y2HGold(pGBKT7-SOC1R109L)以及Y2HGold(pGBKT7-SOC1C137K)。經(jīng)過毒性及自激活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均無自激活和毒性現(xiàn)象。分別將這5個(gè)突變體的酵母轉(zhuǎn)化子與Y187(pGADT7-AGL24)融合后的二倍體酵母均

19、能在選擇型培養(yǎng)基QDO/X/A平板上長藍(lán)色菌落。說明SOC1五個(gè)突變體蛋白能夠與AGL24蛋白相互作用，并激活報(bào)告基因H1S3、AUR1-C、ADE2、MEL1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　酵母β-半乳糖苷酶活性表明:SOC1C137K突變體與AGL24蛋白的作用強(qiáng)度(酶活性為21.58)顯著高于非突變體SOC1（酶活性為4.44）。由此說明SOC1蛋白第137位氨基酸能夠調(diào)節(jié)SOC1/AGL24的聚合強(qiáng)度。另外，SOC1V77K×AGL24

20、、SOC1P81K×AGL24、SOC1K108V×AGL24、SOC1R109L×AGL24雜交組合彼此之間作用強(qiáng)度差異不顯著(酶活性分別為3.14、2.73、2.50和3.19)，但是均顯著低于SOC1×AGL24雜交組合（酶活性為4.44）.
　　通過冷熱刺激法將實(shí)驗(yàn)室提供的SOC1突變體的BiFC重組質(zhì)粒YNEOV77K、YNEOP81K、YNEOK108V、YNEOR109L以及YNEOC137K導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中