芥菜開花整合子FLC與SVP相互作用的研究.pdf

1、開花是有性生殖植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折。延緩開花可在生產(chǎn)上避免“未熟抽薹”;提早開花可以加快品種選育進(jìn)程;調(diào)節(jié)雙親花期有利于F1制種。芥菜開花時(shí)間主要受光照（例如日照長度、日照強(qiáng)度、光周期）、溫度等外在環(huán)境以及植物生長狀況、發(fā)育階段已及遺傳因素等內(nèi)在條件影響。與擬南芥相似，主要有四條途徑調(diào)節(jié)芥菜開花:春化途徑、自主途徑、光周期途徑和赤霉素途徑。盡管這四條途徑分別有不同的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，但最終都匯集到相同的開花途徑整合子。目前，擬

2、南芥中以分離出大量與開花時(shí)間相關(guān)的基因，如FLOWERINGLOCUS T(FT)、SUPPRESSOR OF CO OVEREXPRESSION1 (SOC1、)、FLOWERING LOCUSC(FLC)和SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）等，其中FT與SOC1促進(jìn)開花，F(xiàn)LC與SVP抑制開花。由于芥菜是重要的十字花科蔬菜作物，屬于種子春化類型，在我國南方廣泛種植。因此，對芥菜開花時(shí)間調(diào)控的研究，在生產(chǎn)和實(shí)踐中具

3、有非常重要的意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)以芥菜為研究材料，利用已報(bào)道的開花基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，克隆了兩個(gè)延遲開花的基因FLC與SVP，并構(gòu)建了FLC及其截短體、SVP及其截短體的酵母雙雜交重組表達(dá)載體，篩選與鑒定FLC與SVP相互作用及其蛋白互作的結(jié)構(gòu)域。
　　 1、FLC與SVP的克隆與分析
　　 根據(jù)已發(fā)布的擬南芥和蕓薹屬作物中FLC與SVP基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，從芥菜cDNA中擴(kuò)增出FLC與SVP基因

4、的全長cDNA。FLC基因含有625bp，編碼197個(gè)氨基酸，屬于MIKC型MADS蛋白，進(jìn)化分析表明與蕓薹屬中甘藍(lán)FLC(AAQ76273)親緣關(guān)系最近。SVP基因含有757bp，編碼241個(gè)氨基酸，也屬于MIKC型MADS蛋白，與蕓薹屬中油菜SVP(AAQ55451)親緣關(guān)系最近。
　　 2、全長FLC與SVP相互作用的鑒定
　　 利用同源重組技術(shù)，構(gòu)建了FLC與SVP的酵母表達(dá)載體pGADT7FLC、pGADT7S

5、VP、pGBKT7FLC和pGBKT7SVP。利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母中，得到酵母轉(zhuǎn)化子Y187(pGADT7FLC)、Y187(pGADT7SVP)、Y2HGold(pGBKT7FLC)和Y2HGold(pGBKT7SVP)，經(jīng)過不同缺陷型培養(yǎng)基鑒定，發(fā)現(xiàn)無自激活和毒性現(xiàn)象。融合的二倍體酵母Y187(pGADT7FLC)×Y2HGold(pGBKT7SVP)和Y187(pGADT7SVP)×Y2HGold(pGB

6、KT7FLC)均能在選擇型培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/AbA(DDO/A)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA(QDO/X/A)上正常生長。結(jié)果表明，克隆到的芥菜FLC與SVP蛋白能夠相互接合，為深入研究FLC-SVP作用位點(diǎn)建立一個(gè)技術(shù)平臺(tái)。
　　 3、FLC-SVP相互作用區(qū)域的篩選與鑒定
　　 從全長的FLC和SVP亞克隆

7、了5個(gè)FLC截短體（FL1～５）和5個(gè)SVP截短體（SVP1～5）。FLC1～5和SVP1～5編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域均分別為MI、MIK、K、IKC和KC，并構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pGADT7SVP1～5和pGBKT7FLC1～5，并轉(zhuǎn)化對應(yīng)的酵母菌。二倍體酵母Y187(pGADT7SVP2～5)×Y2HGold(pGBKT7FLC)和Y187(pGADT7SVP)×Y2HGold(pGBKT7FLC2～5)，在QDO/X/A培養(yǎng)基上長出藍(lán)色菌

8、落，同時(shí)激活了酵母的報(bào)告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。由此表明，F(xiàn)LC與SVP2～5能夠相互作用，同時(shí)SVP與FLC2～5也能互作，從而暗示SVP與FLC的K域是介導(dǎo)FLC-SVP二聚化的核心部位。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Y187(pGADT7FLC3)×Y2HGold(pGBKT7SVP3)和Y187(pGADT7SVP3)×Y2HGold(pGBKT7FLC3)二倍體酵母，在QDO/X/A培養(yǎng)基上長出藍(lán)色菌落，表明FLC3