編碼FLC-FLAG和SVP-HA標(biāo)簽蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化芥菜的研究.pdf

1、植物開花的正常調(diào)控是其正常繁衍后代、進(jìn)行物種演化的保障，對(duì)農(nóng)作物來說，開花過程與其產(chǎn)量和品質(zhì)有緊密的關(guān)系，對(duì)于需要收獲營(yíng)養(yǎng)器官的農(nóng)作物，通過延遲開花時(shí)間，延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)周期，得到更高的農(nóng)作物產(chǎn)量有著重要的意義。
　　 芥菜（Brassicajuncea）是十字花科的重要作物，在我國(guó)擁有廣泛的種植面積，抽薹開花是芥菜重要的生物學(xué)特性。在生產(chǎn)實(shí)踐中，“先期抽薹”問題嚴(yán)重地影響了芥菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，是芥菜類蔬菜春季生產(chǎn)的主要問題。通過延遲

2、開花時(shí)間，培育晚抽薹品種是解決這一問題的根本途徑。
　　 植物開花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)的生理發(fā)育過程，開花調(diào)控受環(huán)境的影響，同時(shí)也受基因調(diào)控。分子生物學(xué)研究表明，調(diào)控植物開花的基因分為4類:開花時(shí)機(jī)基因、花分生組織特性基因、花器官特性基因及生物鐘相關(guān)基因。這些基因組成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并通過4種途徑調(diào)控植物開花，包括響應(yīng)外界光信號(hào)的光周期途徑、對(duì)低溫有應(yīng)答的春化途徑、響應(yīng)內(nèi)源激素的赤霉素途徑和感受自身發(fā)育狀況的自主途徑

3、。在模式植物擬南芥中，F(xiàn)LC(FloweringLocusC)和SVP（ShortVegetativePhase）都是開花核心調(diào)節(jié)因子，它們的超量表達(dá)對(duì)開花具有抑制作用。
　　 本試驗(yàn)在芥菜FLC與SVP體外蛋白互作已有基礎(chǔ)之上，將開花抑制基因FLC和SVP同標(biāo)簽蛋白(FLAG，HA)重組后，轉(zhuǎn)入芥菜中，其中標(biāo)簽蛋白用于純化重組蛋白，為FLC和SVP體內(nèi)相互作用的深入研究奠定基礎(chǔ)，對(duì)芥菜花期調(diào)控及解決“先期抽薹”等難題，具有重要

4、意義。
　　 本試驗(yàn)以根芥（BrassicajunceaCoss.）為材料，選取下胚軸作為外植體，建立芥菜高頻再生體系，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染，經(jīng)潮霉素抗性篩選后，將抗性芽生根培養(yǎng)和PCR檢測(cè)，并煉苗移栽，獲得轉(zhuǎn)基因植株和種子。研究結(jié)果如下:
　　 芥菜苗下胚軸在不同濃度NAA和6-BA培養(yǎng)基中，以MS+NAA0.1mg/L+6-BA1mg/L配比獲得的分化率最高，為83.33％;在MS+NAA0.1+6-BA1mg/L培養(yǎng)基

5、上，以不同苗齡(4-8d)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及芽的分化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5d苗齡的下胚軸分化率最高，為42.11％;在不同生根培養(yǎng)基中進(jìn)行下胚軸生根實(shí)驗(yàn)，以培養(yǎng)基1/2MS（3％蔗糖，0.8％瓊脂）+NAA0.1mg/L生根最好，根多且粗壯，根系發(fā)達(dá);當(dāng)潮霉素濃度為4mg/L時(shí)，已完全抑制未經(jīng)轉(zhuǎn)化的下胚軸分化再生，而在2mg/L時(shí)有2.22％的分化率，即潮霉素篩選壓力為4mg/L;在不同羧芐青霉素濃度中(200mg/L，300mg/L，400mg

6、/L，500mg/L)，濃度為300mg/L時(shí)，下胚軸分化率最高，為45.46％。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中，以0-4d進(jìn)行外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的研究，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)2d時(shí)，下胚軸分化率最高，為23.33％，隨著時(shí)間的增加，分化率下降;農(nóng)桿菌侵染10min時(shí)，下胚軸分化率最高，侵染時(shí)間達(dá)20min時(shí)，切口出現(xiàn)嚴(yán)重褐化;在不同農(nóng)桿菌濃度中(OD600:0.1，0.3，0.5，0.7)，OD600為0.5時(shí)獲得了較高的分化率;在共培養(yǎng)試驗(yàn)中，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)0-4d

7、的分化出芽率，其中在共培養(yǎng)3d時(shí)，下胚軸分化率最高，為5.56％。
　　 以試驗(yàn)建立的高頻再生體系進(jìn)行芥菜的遺傳轉(zhuǎn)化，將開花抑制基因FLC和SVP同標(biāo)簽蛋白(FLAG、HA)重組(FLC-FLAG、SVP-HA)，之后與表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1302構(gòu)建正確的35S::FLC-FLAG和35S::SVP-HA，分別記為pCA1302FG、pCA1302SH。分別將這兩種重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，進(jìn)行PCR檢測(cè)。電泳結(jié)果證明pCA13