2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、芥菜(Brassica juncea Coss.)是一種著名的十字花科蕓薹屬蔬菜作物。研究芥菜的抽薹開花及其調(diào)控機理,對于芥菜栽培生產(chǎn)和品種選育等研究有著重要的指導意義。近年來,在模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)了180多種與開花調(diào)控相關(guān)的基因,它們被歸類于6條開花調(diào)控途徑,分別為:光周期途徑、春化途徑、溫敏途徑、年齡途徑、自主途徑和赤霉素途徑。開花整合子(floral integrator)能夠整合不同途徑中的開花信號,形成網(wǎng)絡(luò)通路,最終調(diào)

2、控抽薹與開花時間。其中,SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1(SOC1)和AGAMOUS-LIKE24(AGL24)就是兩個重要的開花信號整合子。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)SOC1和AGL24能形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán),彼此正向調(diào)控對方的mRNA水平,促進二者共同高水平表達,以調(diào)節(jié)開花。在芥菜作物中,SOC1和AGL24之間是否也有這種調(diào)節(jié)機制,它們之間的調(diào)控模式如何,目前尚不清楚。
  為了闡明芥菜SO

3、C1蛋白與AGL24基因相互作用機制,本研究重點檢測了SOC1蛋白是否能作為轉(zhuǎn)錄因子與AGL24啟動子相互作用,并參與啟動AGL24的表達。首先,根據(jù)已知的芥菜AGL24基因序列,通過染色體步移法克隆得到AGL24啟動子序列。其次,構(gòu)建AGL24啟動子截短體與SOC1酵母單雜交重組表達載體,通過酵母單雜檢測了相互作用及其作用區(qū)域。最后,還獲得了SOC1正反義轉(zhuǎn)基因芥菜體系。意在為以后深入研究SOC1蛋白對AGL24基因的表達調(diào)控奠定基礎(chǔ)

4、。試驗結(jié)果詳述如下:
  1、芥菜AGL24啟動子的克隆與生物信息學分析
  提取芥菜基因組DNA,根據(jù)已知的AGL24基因序列,設(shè)計染色體步移法中3個特異性引物,巢式PCR擴增得到AGL24的5’端啟動子區(qū)域3020bp,經(jīng)NCBI序列比對發(fā)現(xiàn)為芥菜AGL24基因5’端啟動子序列。經(jīng)過生物信息學分析,預(yù)測到啟動子核心調(diào)控元件TATA-box、CAAT-box等共193個調(diào)控元件。分析啟動子序列上CArG-box基序,發(fā)現(xiàn)了

5、16個類似CArG-box的結(jié)構(gòu)。說明其在開花調(diào)控中可能受到多個MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,這與其整合子的特質(zhì)名符其實,但與哪些MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用,需后續(xù)試驗進一步研究。
  2、AGL24啟動子截短體與SOC1蛋白的酵母單雜交試驗
  為進一步鑒定芥菜SOC1蛋白與AGL24啟動子的相互作用,對AGL24啟動子上CArG-box序列進行分析后,將其亞克隆為含有完整CArG-box序列的3個截短體(

6、簡稱為AGL24A、AGL24B和AGL24C),其長度分別為923bp、902bp和1096bp,并構(gòu)建相應(yīng)的酵母誘餌表達載體(pAbAi-AGL24A、pAbAi-AGL24B、pAbAi-AGL24C)。同時,亞克隆SOC1基因,構(gòu)建含SOC1的酵母蛋白表達載體pGADT7-SOC1。PCR檢測、雙酶切及測序表明,兩種酵母單雜重組載體構(gòu)建成功。
  再依據(jù)酵母單雜交操作手冊,將pAbAi-AGL24A、pAbAi-AGL24

7、B、pAbAi-AGL24C分別線性化后轉(zhuǎn)入Y1H Gold酵母感受態(tài)細胞,得到酵母誘餌受體菌株Y1H[pAbAi-AGL24A]、Y1H[pAbAi-AGL24B]、Y1H[pAbAi-AGL24C]。AbA背景濃度抗性篩選試驗發(fā)現(xiàn):在SD/-Ura培養(yǎng)基中添加350ng/ml的AbA,能有效抑制上述單轉(zhuǎn)化子菌株的生長。因此,后續(xù)試驗選用350ng/ml的AbA作為最適背景抑菌濃度。進一步將含SOC1的酵母蛋白表達載體pGADT7-S

8、OC1分別轉(zhuǎn)入Y1H[pAbAi-AGL24A]、Y1H[pAbAi-AGL24B]、Y1H[pAbAi-AGL24C]的酵母感受態(tài)細胞中,獲得可表達SOC1蛋白及AGL24截短體的共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y1H[SOC1+AGL24A]、Y1H[SOC1+AGL24B]和Y1H[SOC1+AGL24C],PCR檢測正確后,涂布在含350ng/ml AbA的SD/-Leu缺素培養(yǎng)基(SD/-Leu+AbA350)30℃倒置培養(yǎng)5~7天。并以Y1H

9、[p53-AbAi+ pGADT7-53]作陽性對照,以Y1H[pAbAi-AGL24A+pGADT7]作陰性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Y1H[SOC1+AGL24B]能在缺素培養(yǎng)基上正常生長;而Y1H[SOC1+AGL24A]和Y1H[SOC1+AGL24C]均不能生長。由此酵母單雜交試驗結(jié)果說明,芥菜AGL24啟動子序列中間的截短體AGL24B能與SOC1蛋白發(fā)生相互作用。
  3、芥菜SOC1正反義載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
  根據(jù)芥

10、菜SOC1基因序列,設(shè)計上下游均含BamH I酶切位點的引物組合,從芥菜cDNA中亞克隆SOC1,并分別正向和反向插入pBI121。通過PCR篩選,獲得正義和反義表達載體(分別記為pBI121-SOC1和pBI121-soc1)。以pBI121空載為陰性對照,采用農(nóng)桿菌介導法將SOC1的正反義表達載體pBI121-SOC1和pBI121-soc1轉(zhuǎn)化芥菜下胚軸,并分化增殖。通過抗性篩選和PCR目的基因篩查后,獲得SOC1轉(zhuǎn)基因芥菜植株正

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