柑橘CsGABP啟動子作用元件分析及互作蛋白篩選.pdf

1、有機酸是決定柑橘果實內(nèi)在品質(zhì)的重要組分之一，其含量的高低與果實的衰老進(jìn)程和貯藏性能密切相關(guān)。高含量的有機酸有助于果實的保鮮，因此尋找維持高含量有機酸或減緩有機酸降解的方法來延緩柑橘果實衰老和維持果實品質(zhì)對柑橘采后研究具有重要意義。檸檬酸是柑橘果實中最主要的有機酸，其含量在采后呈波動下降趨勢。GABA代謝支路與TCA循環(huán)緊密聯(lián)系，是調(diào)控檸檬酸含量的重要途徑，參與調(diào)控采后柑橘果實有機酸的降解。GABP（線粒體GABA轉(zhuǎn)運蛋白）是聯(lián)系GABA

2、支路與TCA循環(huán)的紐帶，可作為調(diào)控柑橘果實采后檸檬酸代謝的關(guān)鍵點。尋找GABP上游調(diào)控因子，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平探索GABP對柑橘果實采后檸檬酸代謝的調(diào)控機制，可為開發(fā)調(diào)控柑橘采后有機酸含量及延緩衰老的技術(shù)提供理論依據(jù)。本研究通過克隆柑橘GABP基因（CsGABP）并分析其啟動子順式作用元件，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選及酵母單雜交技術(shù)驗證調(diào)控CsGABP的候選轉(zhuǎn)錄因子，并探討其調(diào)控機制，研究結(jié)果如下:
　　1.克隆得到HB柚和無酸柚CsGABP

3、基因組全長及啟動子序列，并克隆HB柚、無酸柚、冰糖橙、錦橙、沙田柚五個柑橘品種CsGABP基因ORF區(qū)。發(fā)現(xiàn)HB柚和無酸柚各存在兩條CsGABP基因，分別為CsGABP-a，CsGABP-b和CsGABP-a，CsGABP-c，其中CsGABP-a是共有的一條，gDNA相似度高達(dá)99％，啟動子序列相似度高達(dá)98％，而ORF區(qū)在各品種間相對保守且只有一條CsGABP-a，表明可能只有CsGABP-a發(fā)生轉(zhuǎn)錄。
　　2.分析CsGAB

4、P-a基因啟動子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其包括光響應(yīng)元件G-box，GT1-motif，TCT-motif等，逆境相關(guān)的作用元件G-box，W-box，GCC-Box，TGACG-motif等，激素響應(yīng)有關(guān)元件，如G-box和ABRE(ABA)，GCC-box(ETH), TGACG-motif和 CGTCA-motif(MeJA), GARE-motif(GA),TCA-element(SA)，這些作用元件的存在表明CsGABP-a基因的表

5、達(dá)可能受光信號、逆境和激素誘導(dǎo)。
　　3.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并篩到與CsGABP基因共表達(dá)的23個轉(zhuǎn)錄因子基因，通過qRT-PCR進(jìn)行驗證，并對CsGABP基因及挑選轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)趨勢進(jìn)行相關(guān)性分析，挑選到與CsGABP基因表達(dá)顯著相關(guān)的5類共9個候選轉(zhuǎn)錄因子基因:CsWRKY40, CsWRKY33, CsbHLH, CsERF72, CsZF-B, CsBZIP11, CsABR1,CsBZIP21, CsZF-A2。
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6、.預(yù)測候選轉(zhuǎn)錄因子bHLH類，WRKY類，AP2/EREBP類，bZIP類可能綁定元件分別為G-box，W-box，GCC-box，TGACG-motif。設(shè)計并構(gòu)建CsGABP-a啟動子中包含這些元件的8個元件及片段誘餌載體和9個候選轉(zhuǎn)錄因子獵物載體，酵母單雜篩選cDNA文庫及“點對點”驗證發(fā)現(xiàn)CsWRKY33、CsABR1分別與W-Box、GCC-Box作用元件互作，CsbHLH與QbHLH啟動子片段互作，CsZF-B，CsbHLH