Vip3A基因和EF1α啟動(dòng)子的克隆、載體構(gòu)建及其對(duì)煙草的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）在其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期分泌的一種殺蟲蛋白，稱為營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins，Vips)，這種新型高毒力蛋白基因?qū)τ跇?gòu)建高效廣譜的基因工程微生物和培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物、控制害蟲抗性發(fā)展都具有重要意義，被認(rèn)為是第二代抗蟲基因，其中Vip3A蛋白基因研究的最為清楚。
　　本研究利用PCR技術(shù)克隆了Vip3A基因，序列分析表明：該基因全

2、長(zhǎng)2370 bp，編碼789個(gè)氨基酸，其序列及預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)與已知的Vip3A氨基酸的同源性均在99％以上，該基因蛋白分子量為88 KDa，為弱酸性蛋白質(zhì)。對(duì)Vip3A基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸殘基序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：Vip3A基因編碼的蛋白質(zhì)前端具有信號(hào)肽，并且是跨膜信號(hào)，它是一種胞外分泌蛋白，Vip3A蛋白的C端有一個(gè)穩(wěn)定的功能區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示這個(gè)蛋白有較明顯的折疊、螺旋和無規(guī)則卷曲。這些特殊區(qū)域可能與其功能密切相關(guān)。<

3、br>　　為了研究Vip3A基因在轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中的應(yīng)用，及考慮到外源抗蟲基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)水平低的原因，本實(shí)驗(yàn)又利用PCR技術(shù)克隆了煙草的EF1α啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子是一種很好的花組織高效表達(dá)啟動(dòng)子，經(jīng)測(cè)序及序列分析：該啟動(dòng)子全長(zhǎng)1115 bp，含有EF1α基因的起始的63個(gè)編碼堿基序列，含有TATA-box、CAAT-box等多個(gè)保守區(qū)，高效轉(zhuǎn)錄作用元件5UTR Py-rich stretch；抗氧化作用元件ARE；光反應(yīng)元件Box

4、 I、Sp1；乙烯反應(yīng)元件ERE；熱激作用元件HSE；MYB蛋白結(jié)合位點(diǎn)MBS等多個(gè)順式作用元件。
　　將克隆的Vip3A基因和EF1α啟動(dòng)子，以pBI121質(zhì)粒為基本載體，分別成功構(gòu)建了EF1α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的植物表達(dá)載體pBIEF，及由組成型CaMV35S啟動(dòng)子和花特異表達(dá)的EF1α啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Vip3A基因的植物表達(dá)載體pBIVip3A和pBIEFVip3A。且將這些構(gòu)建好的植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)煙草進(jìn)行了遺