急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病大鼠海馬區(qū)HIF-1α及VEGF蛋白動態(tài)表達的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:本研究通過建立DEACMP大鼠模型,應用Morris水迷宮實驗、組織病理學、免疫組織化學染色法、TUNEL細胞凋亡檢測法等技術(shù)檢測大鼠行為學和病理形態(tài)學變化,探討HIF-1α及VEGF在相應動物模型中的表達變化,確定其在DEACMP發(fā)病機制中的作用,為進一步研究DEACMP提供新的思路和方法,為臨床治療提供實驗依據(jù)。
  方法:將78只健康雄性成年SD大鼠(SPF級)隨機分為三組:空白對照組(BC組)18只、空氣對照組(AC

2、組)30只、急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病組(CO組)30只。其中CO組采用腹腔注射法建立急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病大鼠模型,AC組采用腹腔注射法注射等量空氣,BC組不進行任何手術(shù)(腹腔注射)操作。按中毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d六個時間點將三個組各分為6個亞組,其中CO組和AC組每個亞組5只大鼠,BC組每個亞組3只大鼠。各組大鼠在造模前通過Morris水迷宮實驗測試記憶力、定向力等認知功能,7d、14d、21d、28d時間

3、點亞組的大鼠在處死取腦前也進行Morris水迷宮實驗以測試認知功能改變。各組大鼠的腦組織切片均應用HE染色法觀察大鼠海馬區(qū)病理變化,應用免疫組化染色法檢測其海馬區(qū)HIF-1α、VEGF蛋白的表達,用TUNEL細胞凋亡檢測法檢測其海馬區(qū)錐體細胞凋亡情況。運用SPSS17.0軟件對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。
  結(jié)果:1.DEACMP大鼠模型的建立:(1)CO組大鼠腹腔注射CO氣體后出現(xiàn)明顯的中毒反應。表現(xiàn)為染毒后5~15min陸續(xù)出現(xiàn)

4、煩躁、多動,行為表現(xiàn)輕度活躍;染毒20min后大鼠開始出現(xiàn)拒食少動,抖動,呼吸急促,呼吸幅度增大,口唇鼻黏膜和下腹部、肢端皮膚呈現(xiàn)明顯的櫻桃紅色,及行動遲緩,步態(tài)異常等。部分大鼠出現(xiàn)躁狂、撞籠、抽搐、角弓反張,繼而四肢癱軟、昏迷。給予通風、保暖,約36.7%大鼠在染毒24h內(nèi)死亡,存活大鼠約8小時后完全蘇醒,觀察至染毒后第28天,部分大鼠出現(xiàn)反應偏遲鈍,進食量減少,活動減少等表現(xiàn),其余大鼠日常行為活動未見明顯異常。(2) AC組大鼠腹腔

5、注射等量空氣后未見明顯行為學異常,AC組大鼠無死亡。2.Morris水迷宮實驗結(jié)果:(1)定位航行實驗:三個組平均逃避潛伏期在染毒前和染毒后第7d無顯著差別,無統(tǒng)計學意義(P>0.05);染毒后第14d、21d、28d時,CO組平均逃避潛伏期均長于BC、AC組,有統(tǒng)計學差異(P<0.05),BC組與AC組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。(2)空間探索實驗:1)第Ⅳ象限(平臺所在象限)游泳時間/總時間:染毒前、染毒后第14d三個組第Ⅳ象限

6、游泳時間/總時間無統(tǒng)計學差異(P>0.05);染毒后第7d、21d、28d時CO組比AC、BC組小,有統(tǒng)計學差異(P<0.05);BC組、AC組在各時間點上無統(tǒng)計學差異(P>0.05); CO組隨時間變化呈降低趨勢。2)穿越平臺次數(shù):各時間點,三個組經(jīng)過平臺次數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05);各組內(nèi),不同時間點經(jīng)過平臺次數(shù)無統(tǒng)計學差異(P>0.05);28d時CO組有低于其余組的趨勢;CO組隨時間變化,經(jīng)過平臺次數(shù)有降低趨勢。3.腦組織病

7、理形態(tài)學改變:HE染色標本上,(1)各時間點的CO組大鼠腦內(nèi)有廣泛的病理改變,海馬CA1區(qū)出現(xiàn)大量不同程度地神經(jīng)元變性壞死。主要表現(xiàn)為神經(jīng)元胞體腫脹、皺縮,細胞數(shù)目略減少,細胞變形呈梭型或三角形,細胞層變薄、細胞間隙擴大,細胞核固縮、核仁模糊、核周出現(xiàn)空暈,胞質(zhì)與胞核界限不清,細胞結(jié)構(gòu)紊亂,在變性壞死的神經(jīng)元周圍可見不同程度地膠質(zhì)細胞增生浸潤。(染毒后第21d亞組大鼠腦切片中還可以見到壞死神經(jīng)元被吸收后所留下的龕影,周圍亦可見到膠質(zhì)細胞

8、的蹤跡。)(2)BC與各時間點的AC組大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元大小基本正常,核膜完整,核仁清晰,胞核呈淡藍色,著色均勻,細胞器完整。其中,海馬區(qū)CA1區(qū)有兩到三層錐體細胞,排列整齊致密,胞核飽滿、邊界清晰、尼氏小體豐富,核仁深染、清晰。4.HIF-1α及VEGF蛋白的免疫組化染色表達:(1) HIF-1α表達:HIF-1α在BC組及AC組中表達少,CO組在染毒后第1d表達明顯升高,第3d達到高峰,然后逐漸降低,至28d時仍有較高表達,CO組H

9、IF-1α表達量在各時間點均高于BC組及AC組,有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。(2) VEGF表達:VEGF在BC組及AC組中表達少;CO組除第14d外,其余各時間點上VEGF的表達量均高于BC和AC組,有統(tǒng)計學差異(P<0.05);CO組VEGF表達量從染毒后第1d開始迅速升高,在第3d達最高峰后逐漸降低,至第21d時再次顯著升高形成次高峰,繼而又持續(xù)降低,至第28d時VEGF表達量接近第1天水平,表現(xiàn)為增高→降低→增高→降低的動態(tài)變

10、化趨勢。5.TUNEL細胞凋亡檢測結(jié)果:CO組于染毒后第1d時檢測出大腦海馬CA1區(qū)有少量神經(jīng)細胞凋亡,第3d時開始增多,第7~14天達到高峰(第7天為最高峰),第28d時仍有少量凋亡,凋亡指數(shù)較BC組及AC組明顯增高,有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。
  結(jié)論:1.采用改良式多次間隔腹腔注射CO法制作大鼠DEACMP模型,設備要求低,操作簡便易掌握,干擾因素少,CO用量少、精確,并且與人體DEACMP的病理生理變化過程相近,是研究

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