RNA干擾AKT2對(duì)胰腺癌吉西他濱化療敏感性的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、胰腺癌是一種臨床表現(xiàn)隱匿、發(fā)展迅速、預(yù)后很差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，該疾病早期診斷十分困難，治療方法相當(dāng)有限，總體死亡率很高。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，胰腺癌的總體死亡率已由第5位升至第4位。而在中國(guó)，胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤的三大死亡原因之一，85%的患者在初次就診時(shí)已屬晚期，根治性胰腺癌手術(shù)切除率僅為10%～15%，5年總體生存率不到5%。目前化學(xué)治療仍是胰腺癌綜合治療的重要手段之一。吉西他濱屬于新一代阿糖胞苷類(lèi)似物，臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)可以有效改善晚期

2、胰腺癌患者的疾病相關(guān)癥狀和并提高患者生活質(zhì)量，于1996年被美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)正式取代5-氟尿嘧啶成為抗胰腺癌一線(xiàn)藥物，并被廣泛視作臨床研究的―金標(biāo)準(zhǔn)。1997年一項(xiàng)關(guān)于吉西他濱的Ⅲ期臨床試驗(yàn)顯示，吉西他濱可顯著改善患者癥狀、延長(zhǎng)患者中位生存期并使患者受益。但是惡性腫瘤化療的耐藥性是影響化療效果、疾病預(yù)后的最大問(wèn)題。如何提高吉西他濱為主的胰腺癌化療敏感性成為當(dāng)前臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　 近年以來(lái)，

3、已經(jīng)有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究顯示PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路系統(tǒng)與惡性腫瘤化療耐藥關(guān)系十分密切。多藥耐藥基因(mdr-1)家族是研究最早的目前公認(rèn)的惡性腫瘤多藥耐藥相關(guān)基因。多藥耐藥基因的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞生存力增強(qiáng)，抗化療藥物及抗凋亡能力增強(qiáng)，從而降低多種腫瘤化療藥物的細(xì)胞毒性作用。而這個(gè)過(guò)程受很多因素影響，其中PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路系統(tǒng)在其中發(fā)揮了十分重要的作用。已有多項(xiàng)研究表明PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)通過(guò)上調(diào)(mul

4、tidrugresistance-related protein 1，MRP1)MRP1的表達(dá)而導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥現(xiàn)象，MRP1基因表達(dá)水平與PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)水平在急性髓性白血病細(xì)胞中呈正相關(guān)性關(guān)系。另有研究利用傳統(tǒng)的PI3K 抑制劑渥曼青霉素來(lái)抑制Akt基因的磷酸化活化之后，MRP1基因的表達(dá)水平也隨之下降。Abdul-Ghani等的實(shí)驗(yàn)研究也表明PI3K/Akt信號(hào)通路可以顯著上調(diào)MRP1基因的表達(dá)水平，從而降

5、低惡性細(xì)胞的凋亡，而另一種PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑LY294002 能夠使惡性腫瘤細(xì)胞凋亡率大幅度提高。
　　 以上這些結(jié)果均提示我們沉默AKT基因表達(dá)可能成為臨床上增加胰腺癌化療敏感性的一種可行性的方法。
　　 按照以上實(shí)驗(yàn)設(shè)想并在我的導(dǎo)師王春友教授的指導(dǎo)和支持下，我在我院普外科實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了RNA干擾AKT2對(duì)胰腺癌吉西他濱化療敏感性的影響及相關(guān)機(jī)制研究。為此，我們通過(guò)(1)RNA干擾胰腺癌細(xì)胞AKT2的表達(dá)對(duì)

6、吉西他濱敏感性的體外實(shí)驗(yàn)，(2)RNA干擾AKT2對(duì)胰腺癌裸鼠移植瘤的吉西他濱敏感性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，這兩部分來(lái)觀察RNA干擾AKT2對(duì)胰腺癌吉西他濱化療敏感性的影響。然后通過(guò)(3)建立胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞系，(4)RNA干擾AKT2表達(dá)逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞耐藥的實(shí)驗(yàn)研究，這兩部分來(lái)初步探討RNA干擾AKT2對(duì)改變胰腺癌耐藥性的相關(guān)機(jī)制。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步闡明胰腺癌化療耐藥的分子生物學(xué)機(jī)理，從而在分子水平上尋找其中的關(guān)鍵基因并開(kāi)發(fā)相應(yīng)靶向治療，

7、達(dá)到提高胰腺癌化療療效提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分：PANC-1細(xì)胞中AKT2的表達(dá)對(duì)吉西他濱敏感性的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：
　　 研究胰腺癌細(xì)胞Panc-1中AKT2的表達(dá)對(duì)吉西他濱敏感性的影響。
　　 方法：
　　 在體外條件下將AKT2特異性siRNA表達(dá)載體pAKT2-siRNA轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1，應(yīng)用RT-PCR、Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后Panc-1

8、細(xì)胞中AKT2基因mRNA和蛋白的表達(dá)變化，應(yīng)用MTT法檢測(cè)RNA干擾AKT2后Panc-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱敏感性的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 轉(zhuǎn)染AKT2 siRNA后Panc-1細(xì)胞AKT2基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著下降；吉西他濱對(duì)Panc-1細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞抑制量從1.96±0.22μg/ml降到0.24±0.03μg/ml，Panc-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性顯著增加。
　　 結(jié)論：
　　 A

9、KT2 siRNA 能夠抑制AKT2表達(dá)，并能增加胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1對(duì)吉西他濱的敏感性。
　　 第二部分：RNA干擾AKT2對(duì)人胰腺癌裸鼠移植瘤的吉西他濱敏感性的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：
　　 研究RNA干擾AKT2對(duì)人胰腺癌裸鼠移植瘤的吉西他濱敏感性的影響。
　　 方法：
　　 首先構(gòu)建荷胰腺癌的裸鼠模型，采用腹腔給藥和瘤內(nèi)注射方式，以吉西他濱配合AKT2 siRNA表達(dá)載體對(duì)瘤鼠進(jìn)行聯(lián)合干

10、預(yù)治療以對(duì)比觀測(cè)各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，RT-PCR檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞的AKT2 mRNA表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腫瘤AKT2 蛋白表達(dá)，DNA 末端原位標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)各組腫瘤組織細(xì)胞的凋亡指數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 化療+AKT2-siRNA組移植瘤組織中AKT2 mRNA 及AKT2 蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組、化療組以及化療+陰性質(zhì)粒組?；?AKT2-siRNA組腫瘤重量、腫瘤體積顯著低于其他各對(duì)

11、照組?；?AKT2-siRNA組抑瘤率、凋亡指數(shù)顯著高于其他各對(duì)照組。
　　 結(jié)論：
　　 RNA干擾AKT2 能夠顯著提高胰腺癌吉西他濱化療的敏感性。
　　 第三部分：胰腺癌吉西他濱化療耐藥細(xì)胞系的建立及其特性鑒定
　　 目的：
　　 建立胰腺癌吉西他濱化療耐藥細(xì)胞系，并對(duì)該細(xì)胞系的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。
　　 方法：
　　 通過(guò)逐步遞增細(xì)胞培養(yǎng)基中吉西他濱的濃度，建立對(duì)吉西他濱

12、化療耐藥的胰腺癌細(xì)胞系Panc1-Gem。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法和集落形成實(shí)驗(yàn)兩種方法，計(jì)算出Panc1和Panc1-Gem 兩種細(xì)胞系的半數(shù)細(xì)胞抑制濃度(IC50)及耐藥系數(shù)(RI)：對(duì)比觀察Panc1和Panc1-Gem 兩細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，并計(jì)算出Panc1和Panc1-Gem 兩細(xì)胞系的倍增時(shí)間。
　　 結(jié)果：
　　 吉西他濱對(duì)Panc1的IC50為1.96±0.22μg/ml和吉西他濱對(duì)Panc1-Ge

13、m的IC50為239.82±35.47 μg/ml，MTT所測(cè)的RI 值為122.36(P<0.05)。集落形成實(shí)驗(yàn)的所得RI為118.93。根據(jù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)計(jì)算出Panc1的倍增時(shí)間為27.1h，Panc1-Gem的倍增時(shí)間為35.2h。
　　 結(jié)論：
　　 已成功構(gòu)建了對(duì)吉西他濱化療耐藥的胰腺癌細(xì)胞系Panc1-Gem，耐藥性能十分明顯而穩(wěn)定,該細(xì)胞系適合用于胰腺癌吉西他濱化療耐藥的研究。
　　 第四部分：AKT

14、2 在胰腺癌細(xì)胞吉西他濱化療耐藥中的作用
　　 目的：
　　 研究AKT2、多藥耐藥基因(mdr-1）以及脫氧胞苷激酶(dCK)，在人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1 吉西他濱(GEM)化療耐藥中的相互關(guān)系及調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 通過(guò)逐步增加藥物濃度的方法，誘導(dǎo)建立了耐吉西他濱的胰腺癌細(xì)胞系。應(yīng)用RNA干擾耐吉西他濱的胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)KT2表達(dá)來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)化療耐藥實(shí)驗(yàn)，并采用了Western Blot、RT

15、-PCR 以及MTT法，來(lái)評(píng)價(jià)AKT2與mdr-1、dCK 兩個(gè)基因表達(dá)情況的相互調(diào)控關(guān)系及評(píng)估逆轉(zhuǎn)化療耐藥的效果。
　　 結(jié)果：
　　 Western Blot、RT-PCR結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞Panc1-GEM的mdr-1 在蛋白表達(dá)、mRNA轉(zhuǎn)錄水平上比其親本細(xì)胞系Panc1增強(qiáng)，而脫氧胞苷激酶(dCK)基因在蛋白表達(dá)、mRNA轉(zhuǎn)錄水平上比其親本細(xì)胞系Panc1 減弱。經(jīng)過(guò)RNA干擾耐GEM的胰腺癌細(xì)胞株AKT2表達(dá)

16、作用后，mdr-1 在蛋白表達(dá)、mRNA轉(zhuǎn)錄水平上減弱，而脫氧胞苷激酶(dCK)基因在蛋白表達(dá)、mRNA轉(zhuǎn)錄水平上增強(qiáng)。耐藥細(xì)胞Panc1-GEM對(duì)吉西他濱的IC50為239.82±35.47 μg/ml，耐藥系數(shù)（RI）為121.94；經(jīng)過(guò)RNA干擾耐GEM的胰腺癌細(xì)胞株AKT2表達(dá)作用后對(duì)吉西他濱的IC50為113.45±21.89 μg/ml，RI為57.88。
　　 結(jié)論：
　　 胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥的原因與