沉默Bmi1基因增強胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性的實驗研究.pdf

1、第一部分、Bmi1‐siRNA增強胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性
　　目的：設(shè)計針對人的Bmi1-siRNA，轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞后檢測轉(zhuǎn)染Bmi1-siRNA對胰腺癌細胞Bmi1基因和蛋白表達的影響；研究沉默胰腺癌細胞的Bmi1基因表達后再經(jīng)不同濃度吉西他處理后的半抑制濃度（IC50），探討沉默胰腺癌細胞Bmi1基因的表達對吉西他濱敏感性的影響。
　　方法：將Bmi1基因的靶向小片段siRNA通過Lipofectamine200

2、0的介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人的胰腺癌細胞（Panc-1細胞系），48小時后分別用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白免疫印跡實驗（Western Blot）檢測Bmi1 mRNA與蛋白的表達。用不同濃度的吉西他濱處理轉(zhuǎn)染Bmi1-siRNA的胰腺癌細胞，48小時后MTT法檢測各組細胞的OD值，然后計算各組細胞的IC50(半抑制濃度)。
　　結(jié)果：Bmi1-siRNA組Bmi1基因的表達較對照組減少了約3/4；蛋白的表達減少了約2/3；

3、Bmi1-siRNA組的IC50明顯下降。
　　結(jié)論：Bmi1-siRNA明顯減少了胰腺癌細胞Bmi1 mRNA及蛋白的表達；且顯著增強了胰腺癌細胞（Panc-1細胞系）對吉西他濱的化療敏感性。
　　第二部分、Bmi1-siRNA促進吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌細胞的凋亡
　　目的：研究沉默胰腺癌細胞Bmi1基因的表達對吉西他濱誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的影響。
　　方法：用10umol/L的鹽酸吉西他濱處理胰腺癌細胞，并設(shè)立實驗

4、對照組（不加吉西他濱）。通過流式細胞術(shù)（Flow cytometry）檢測空白對照組、NC-siRNA組、Bmi1-siRNA組在吉西他濱處理48h后的腫瘤細胞凋亡率和線粒體膜電位。
　　結(jié)果：胰腺癌細胞Bmi1-siRNA組在吉西他濱處理后細胞的線粒體膜電位較空白對照組和NC-siRNA組均明顯降低；Bmi1-siRNA組在吉西他濱處理后的腫瘤細胞凋亡率較空白對照組和NC-siRNA組均明顯升高。
　　結(jié)論：Bmi1-si

5、RNA可以促進吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌細胞的凋亡。
　　第三部分、Bmi1-siRNA抑制吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌腫瘤干細胞的表達
　　目的：研究 Bmi1-siRNA對吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌腫瘤干細胞的表面標記性蛋白CD133和CD24的表達的影響。
　　方法：通過流式細胞術(shù)（Flow cytometry）檢測胰腺癌細胞在未加藥、加吉西他濱處理、轉(zhuǎn)染后再加入吉西他濱處理三組細胞的腫瘤干細胞表面標記性蛋白 CD133和CD24的

6、表達。
　　結(jié)果：加吉西他濱處理后的胰腺癌細胞的CD133和CD24的表達率較空白組明顯增加；Bmi1-siRNA+Gem（10umol/L）組的胰腺癌細胞CD133和CD24的表達率較僅用吉西他濱處理細胞組明顯下降。
　　結(jié)論：Bmi1-siRNA能夠抑制吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌腫瘤干細胞的表達。
　　第四部分、EMT抑制可能是Bmi1-siRNA增強胰腺癌細胞對吉西他濱敏感性的作用機制之一
　　目的：研究Bmi1

7、-siRNA對胰腺癌細胞鈣黏蛋白E（E-cadherin）的基因表達的影響；以及對鈣黏蛋白E（E-cadherin）、鈣黏蛋白N（N-cadherin）、波形蛋白Vimentin的蛋白表達的影響。
　　方法：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測沉默胰腺癌細胞Bmi1基因后鈣黏蛋白E（E-cadherin）基因的表達水平；用蛋白免疫印跡實驗（Western BIot）檢測沉默胰腺癌細胞Bmi1基因后鈣黏蛋白E（E-ca