MUC1-ETR-pDC316載體介導(dǎo)的胰腺癌特異性MR分子顯像初步研究.pdf

1、研究背景：胰腺癌是現(xiàn)今惡性程度最高、預(yù)后最差的腫瘤之一，早期診斷率低下是胰腺癌死亡率極高的重要原因。目前常規(guī)的影像學(xué)及腫瘤標(biāo)志物檢查難以對胰腺癌作出有效的早期診斷。黏蛋白1(MUC1)基因的異常表達已被證實是胰腺癌等腫瘤的早期相對特異性分子生物學(xué)改變，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)介導(dǎo)的分子顯像可提供分子水平的顯像能力，將兩者的優(yōu)勢聯(lián)合構(gòu)建一種新型的顯像方法，可為胰腺癌的早期特異性診斷提供幫助。在前期研究中我們擴增了MUC1基因啟動子中與組織特

2、異表達有關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控序列，并將不含有啟動子及3'端不穩(wěn)定序列的TfR編碼序列(ETR)置于該啟動子的控制下，以pDC316穿梭質(zhì)粒為載體構(gòu)建了MUC1-ETR/pDC316真核表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有驅(qū)動ETR基因在muc1基因陽性的胰腺癌細胞中不受鐵濃度負反饋調(diào)節(jié)，特異性表達大量TfR，并被磁性探針靶向標(biāo)記而顯像的潛力。
　　 目的：⑴驗證MUC1-ETR/pDC316真核表達載體在muc1陽性細胞內(nèi)的特異性表達。⑵通過體外MR成

3、像探討以TfR為報告分子反映細胞內(nèi)muc1基因異常表達的可行性，為體內(nèi)實驗和進一步靶向治療研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法：①EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切MUC1-ETR/pDC316質(zhì)粒，切膠回收純化獲得ETR片段，雙向測序證實序列正確；將ETR基因與EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切后的pDC316質(zhì)粒連接并測序證實插入位置、方向及序列正確。②TRIzol法提取胰腺癌細胞株Capan-2、Panc-1及乳腺癌細胞株MDA-MB-231總RN

4、A，以文獻報道的muc1和β-actin基因引物對各株細胞總RNA進行RT-PCR擴增，2％瓊脂糖凝膠分離產(chǎn)物，分析muc1基因表達情況。③各株細胞分為未處理組、陰性對照組、實驗組和陽性對照組，后三組分別以pDC316空質(zhì)粒、MUC1-ETR/pDC316質(zhì)粒及MCMV-ETR/pDC316質(zhì)粒進行瞬時轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72小時分別對各組取樣，提取總RNA，實時熒光定量PCR擴增TfR基因，觀察不同時點各株細胞各處理組TfR

5、 mRNA表達。④各株細胞分別轉(zhuǎn)染實驗組、陽性對照組質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染后48小時進行流式細胞術(shù)檢測，比較各株細胞各處理組細胞表面TfR平均熒光強度。⑤將Panc-1細胞按實驗組和陽性對照組轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒后48小時，于培養(yǎng)基中加入人飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白(holo-Tf至終濃度800μg/mL，37℃孵育2小時后用原子吸收分光光度法測定細胞內(nèi)鐵濃度，另設(shè)未處理組和僅加Tf組為對照。⑥各株細胞分別轉(zhuǎn)染實驗組和陽性對照組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48小時消化細胞，計數(shù)后均取

6、106個細胞標(biāo)記抗人CD71免疫磁珠，進行體外MR顯像，分析T2弛豫率的改變。另設(shè)未標(biāo)記細胞和明膠為對照。⑦所有計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組實驗重復(fù)3批次。兩個獨立樣本之間的以t檢驗進行比較，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，p＞0.05表示差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)分析軟件為SPSS11.0。
　　 結(jié)果：⑴雙酶切及連接反應(yīng)后對所構(gòu)建的載體進行雙向測序鑒定證實序列及插入位置、方向正確，成功構(gòu)建MC

7、MV-ETR/pDC316陽性對照質(zhì)粒。⑵RT-PCR擴增muc1和β-actin基因后，產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下可見Capan-2、Panc-1細胞株可擴增出489bp的muc1條帶，MDA-MB-231細胞在該位置無條帶，各株細胞內(nèi)參基因β-actin條帶位置及亮度一致。⑶各株細胞陽性對照組在轉(zhuǎn)染后24-72小時TfR mRNA表達量較未轉(zhuǎn)染細胞均明顯上調(diào)(p＜0.01)；muc1陽性的Capan-2、Panc-1細胞在轉(zhuǎn)

8、染實驗組質(zhì)粒后24-72小時TfR mRNA亦較未轉(zhuǎn)染細胞明顯上調(diào)(p＜0.01)，但上調(diào)幅度低于陽性對照組；MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染實驗組后24小時TfR mRNA亦較未轉(zhuǎn)染組上調(diào)，幅度低于Capan-2、Panc-1細胞，48小時后表達量與未處理組及陰性對照組無明顯差異；各株細胞陽性對照組和實驗組轉(zhuǎn)染后TfR mRNA表達上調(diào)隨時間延長有下降的趨勢；各株細胞陰性對照組轉(zhuǎn)染前后TfR mRNA表達與未處理組無明顯差異。⑷Capan

9、-2、Panc-1細胞在轉(zhuǎn)染實驗組和陽性對照質(zhì)粒后48小時，表面TfR平均熒光強度較未處理細胞明顯增強(p＜0.05)，提示細胞表面TfR蛋白表達增加；MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染實驗組質(zhì)粒后48小時平均熒光強度無增強。以上結(jié)果和mRNA表達變化情況基本一致，支持轉(zhuǎn)染MUC1-ETR/pDC316質(zhì)?？蛇x擇性上調(diào)muc1陽性細胞表面TfR的推測。⑸在富鐵環(huán)境下孵育2小時后，僅加holo-Tf一組以及實驗組、陽性對照組細胞內(nèi)鐵含量均較未處

10、理細胞有上升趨勢，初步證明上調(diào)的TfR具有正常的攝鐵功能，可增加細胞的鐵攝入。⑹Capan-2、Panc-1細胞實驗組在轉(zhuǎn)染后48小時進行的MR成像中T2馳豫率均較未處理組有下降趨勢，；MDA-MB-231細胞實驗組與未處理組在MR信號上無明顯改變；三株細胞的陽性對照組較未處理組均有明顯的T2馳豫率下降。以上MR信號差別尚難以用肉眼分辨。
　　 結(jié)論：①實驗證實MUC1-ETR/pDC316質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可特異性表達于muc1基因陽