優(yōu)化rAAV載體以高效轉導HSCs并介導紅系特異性蛋白表達.pdf

1、前言：β-地中海貧血、鐮刀細胞性貧血等血紅蛋白疾病是由β-珠蛋白基因單點突變所導致的、全世界發(fā)病率最高的遺傳病。目前唯一可以根治此類疾病的治療方法是異體骨髓移植，缺少與患者人類白細胞抗原(HLA)相匹配的骨髓供體極大程度上限制了異體骨髓移植的應用，因此，尋找替代異體骨髓移植的治療方法極為重要。隨著人類對生命科學的深入了解，基因轉移技術的研究日益深入，基因治療成為各種遺傳性或獲得性疾病治療的新的希望。自上個世紀九十年代美國第一例基因治療臨

2、床試驗開展以來，全世界已開展了超過1800個基因治療臨床試驗項目[1]?；蛑委煂Ζ?地中海貧血與鐮刀細胞性貧血這類單基因突變引起的遺傳病的治療尤為理想。以病人自身的造血干細胞(HSCs)為靶細胞，通過病毒載體或非病毒載體導入正常的β-珠蛋白基因，再將基因修飾后的自體骨髓細胞回輸入病人體內，這種結合了基因治療的自體骨髓移植成為替代異體骨髓移植最有前景的治療方法。2010年有報道表明，重組慢病毒載體攜帶正常β-珠蛋白基因在臨床試驗中在一定

3、程度上糾正了患有重型β-地中海貧血病人的貧血癥狀，但受試病人在可減少輸血頻率的同時，也出現(xiàn)了癌前基因HMGA2的轉錄激活[2]，因此，慢病毒基因載體的安全性，仍是其在基因治療應用中最大的隱患。在諸多的病毒載體中，腺相關病毒(AAV)是唯一被美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)及美國食品和藥品管理局(FDA)劃分在安全級別一級(RG1)的病毒，即不導致任何疾病的病毒載體。其中，由于2型腺相關病毒載體(AAV2)的安全性及其對多種組織細胞的高轉導效

4、率，AAV2已被廣泛應用于多種疾病基因治療Ⅰ-Ⅲ期的臨床試驗，如肺囊性纖維化[3]、血友病B[4]、先天性黑蒙癥[5-7]等。2012年，歐洲藥品管理局(EMEA)批準了由荷蘭uniQure公司研制與申報的基因藥物Glybera的正式上市[8，9]。該藥以AAV為載體，轉導脂蛋白脂酶基因以治療脂蛋白脂酶缺乏癥，是全球第一個上市的AAV基因藥物。Glybera獲準上市，進一步證明了AAV載體的安全性與有效性，AAV介導的基因治療研究成為目

5、前國際研究熱點。然而，AAV2對HSCs的轉導效率不夠理想[10-17]，且其他新型AAV血清型如AAV1-AAV10對HSCs的轉導效率的研究，目前鮮有報道。在此類疾病基因治療的前期研究中，小鼠、猴是常用的動物實驗模型，但AAV各種血清型對小鼠、猴及人HSCs的轉導效率是否存在種屬差異性尚無任何報道。最近，本實驗室對AAV2外殼蛋白進行定點突變改造，可大幅度提高AAV2對肝臟等組織/細胞的轉導效率[18]。但定點突變外殼蛋白是否可以提

6、高AAV對HSCs的轉導效率，目前仍是一個空白區(qū)域。血紅蛋白疾病的基因治療，不僅僅需要載體對HSCs的高轉導效率，還需要載體介導靶基因在紅系高效且特異性表達目的蛋白，因此，優(yōu)化啟動子以提高其活性及紅系特異性極為關鍵。對以上問題的深入研究，將有望提高AAV對HSCs的轉導效率，并介導目的基因在紅系高效特異性表達，有望為此類血紅蛋白疾病的基因治療提供理想載體，為其臨床應用提供依據(jù)。
　　目的：①分析AAV對來源于小鼠、猴與人HSCs轉

7、導效率的種屬差異性，在血清型AAV1-10中，篩選出對人HSCs轉導效率最高的AAV血清型，以在實驗設計中指導AAV血清型的選擇及最佳動物模型的選擇;②對轉導人HSCs的最佳血清型的受體/輔受體進行系統(tǒng)篩選與分析，并研究該血清型的整合特性，以明確該最佳血清型對人HSCs高轉導效率的機制，并為將來的臨床試驗提供篩選病人的指標;③對最佳AAV血清型的外殼蛋白進行單點突變，在體外及體內篩選最佳單點突變型載體，并聯(lián)合單點氨基酸突變構建雙突變型載

8、體，以進一步提高對人HSCs的轉導效率;④優(yōu)化載體啟動子，構建含紅系特異性啟動子B19p6的雙突變型載體以介導紅系特異性蛋白表達。
　　方法與結果：⑴系統(tǒng)包裝攜帶增強綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的AAV1-AAV10載體，體外比較其對來源于小鼠，猴及人的HSCs的轉導效率。結果表明:10個血清型中，AAV1對小鼠Sca-1+，c-kit+，lin-細胞的轉導效率高于其它血清型，但對人CD34+細胞轉導效率較低;AAV6對小鼠S

9、ca-1+，c-kit+，lin-細胞的轉導效率并不理想，但AAV6對人CD34+細胞轉導效率顯著高于其他血清型;而AAV1-10對猴CD34+細胞的轉導效率都不理想。說明AAV對HSCs的轉導效率存在顯著的物種差異性;⑵以人紅白血病細胞(K562)為細胞模型，通過血清抑制試驗、紅細胞糖苷競爭實驗、肝素競爭實驗、成纖維生長因子(bFGF)競爭實驗、胰島素樣生長因子1(IGF-1)競爭實驗等競爭性抑制實驗，與細胞糖基化抑制、磷脂酶A2、唾

10、液酸苷酶、蛋白酶K等細胞處理實驗及載體示蹤記錄實驗，對AAV6所介導的高效且長期的蛋白表達機制進行研究。在示蹤實驗中，應用Cy3標記不同的AAV血清型的外殼蛋白，并應用共聚焦顯微鏡檢查病毒進入靶細胞的情況，結果發(fā)現(xiàn):AAV6進入靶細胞的幾率遠遠高于其他血清型，這可能是其高轉導效率的主要原因。除血清以外，紅細胞糖苷、肝素、bFGF與IGF-1對AAV6的轉導效率無競爭性抑制作用。應用唾液酸酶、磷脂酶A2等對細胞進行預處理對轉導效率無顯著影

11、響，而用蛋白酶K預處理細胞可降低AAV6的轉導效率。⑶通過定點突變的方法，將對人CD34+細胞轉導效率最高的AAV6外殼蛋白表面的Y252等六個酪氨酸殘基(Y)突變?yōu)楸奖被釟埢?F)，并分別包裝雙鏈AAV-EGFP載體或單鏈AAV-mCherry載體，在體外篩選單點突變載體對人CD34+細胞的轉導效率。結果發(fā)現(xiàn)Y705F等單點突變對人CD34+細胞的轉導效率顯著高于未突變及其它單點突變載體。本實驗室進一步應用包含單點突變的病毒載體轉

12、導人CD34+細胞，進行NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl(NOD/SCID)免疫缺陷小鼠異種移植實驗，檢測這些單點突變載體在體內介導基因的表達情況。結果進一步證實:所構建的包含酪氨酸單點突變的AAV6載體的轉導效率顯著高于未突變型載體，可介導目的基因長期高效表達。⑷結合兩個最佳單點突變，構建雙突變載體，有望進一步提高載體對人HSCs的高轉導效率。同時，構建含非特異性啟動子CBAp，及紅系特異性啟動子B19p6或HS2-

13、βp驅動下的雙鏈AAV-EGFP以及雙鏈AAV-GLuc病毒載體，可對其在體內、體外介導的基因表達情況進行直觀的比較與分析。對HSCs在體外進行紅系特異性誘導分化，可比較分化前后轉導基因在不同啟動子驅動下的表達水平以分析啟動子的紅系特異性。結果表明，與分化前相比，B19p6與HS2-βp啟動子驅動下，基因表達分別可以提高30倍與22倍，而CBAp啟動子驅動下的基因表達，在誘導前后無顯著性差異。⑸在NOD.Cg-Prkdcscid I12

14、rgtm1Wj1/SzJ(NSG)小鼠模型中平行比較三種啟動子驅動下的未突變型AAV6及雙突變型AAV6載體所介導的基因表達水平。該部分研究進行了兩次移植實驗，第一次將經載體轉導的人HSCs移植入NSG小鼠，移植后第3周開始直至第12周進行基因表達水平監(jiān)控，并于移植后的第12周，處死受體鼠，分離其骨髓細胞及脾臟細胞，檢測人細胞的百分比，以確定異種移植是否成功，并進一步檢測各種細胞的基因表達水平，以確定基因表達是否局限于紅系特異性。同時，

15、將首次移植成功的受體鼠的骨髓細胞再次移植入新的NOD/SCID鼠或NSG小鼠，重復以上檢測，繼續(xù)評估載體介導目的基因的長期表達情況。結果表明，B19p6啟動子驅動下的雙突變AAV6載體所介導的基因表達水平最高。
　　結論：本研究所構建的B19p6啟動子驅動下的包含雙突變的AAV6載體為以HSCs為靶細胞的遺傳性疾病，尤其是β-地中海貧血或鐮刀細胞性貧血等血紅蛋白疾病的基因治療研究提供了安全有效的理想載體，對此類疾病的基因治療最終走