突變特異性K-ras反義基因及siRNA對胰腺癌基因沉默治療的臨床前研究.pdf

1、胰腺癌(pancreaticcarcinoma，Pca)是嚴(yán)重危害人類生命健康的惡性腫瘤之一，其惡性程度極高而且發(fā)病隱匿，難以早期診斷和治療，臨床確診者大多屬于晚期癌。胰腺癌的預(yù)后極差，5年生存率總體低于5％。除早期手術(shù)外，尚無其他有效治療措施，而且由于很難早期診斷，只有大約14％的患者可以選擇手術(shù)治療。近年來胰腺癌發(fā)生率在國內(nèi)外均呈逐年上升趨勢，據(jù)報(bào)道，近十年發(fā)病率上升了3～7倍。1991年，Hrudan等統(tǒng)計(jì)，胰腺癌是美國地區(qū)腫瘤死

2、亡原因的第四位，僅次于肺癌，結(jié)腸癌和乳腺癌。在我國，隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的變化，胰腺癌的發(fā)病率從1980年的第二十上升到第五位。上海疾控中心2000年統(tǒng)計(jì)的胰腺癌發(fā)病率為每十萬人有6人發(fā)病，其中5.5人死亡，發(fā)病率幾乎接近于死亡率，這一數(shù)字觸日驚心。 1988年，AlmogueraC發(fā)現(xiàn)，95％(21/22)的人類胰腺癌存在K-ras基因的第12密碼子點(diǎn)突變。在以后的不斷研究中，人們逐漸認(rèn)識到，所有參與胰腺癌發(fā)生、發(fā)

3、展的基因中，與胰腺癌關(guān)系最為密切的是K-ras基因。K-ras基因表達(dá)的ras蛋白被稱為K-rasp21蛋白，K-rasp21蛋白作為鳥苷三磷酸腺苷酶(Guanosinetriphosphatase，GTPase)的作用與GTP或GDP結(jié)合，并使GTP水解為GDP和無機(jī)磷酸，是細(xì)胞外的信息通過受體向細(xì)胞內(nèi)傳遞時(shí)的調(diào)制劑(Modulator)。K-ras基因第12密碼子正常情況下為GGT，編碼甘氨酸(glycin)。當(dāng)這三個(gè)堿基發(fā)生突變，

4、其表達(dá)的K-rasp21蛋白也發(fā)生改變，從而影響了細(xì)胞正常的信號傳遞，并在其他致癌因素作用下，使細(xì)胞發(fā)生癌變。胰腺癌是目前已知的K-ras癌基因突變率最高的惡性腫瘤，K-ras基因突變率高達(dá)70％～100％，其中95％的突變發(fā)生在第12位密碼子。 轉(zhuǎn)基因治療的技術(shù)關(guān)鍵在于選擇有效的目的基因即具有高選擇性和高特異性的載體。近年來基礎(chǔ)和臨床研究大多應(yīng)用cytokeine的插入以直接殺傷腫瘤細(xì)胞或誘導(dǎo)機(jī)體的局部或全身免疫反應(yīng)以控制腫瘤

5、的生長，或插入目的基因以消除異?；虻谋磉_(dá)。載體主要有病毒性載體和非病毒性載體兩大類。前者多用反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，或腺相關(guān)病毒；后者則多用脂質(zhì)體，基因槍，或腫瘤內(nèi)注射。 自從Johnston設(shè)計(jì)的氦動(dòng)力基因槍問世并應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)以來，基因槍已成為醫(yī)學(xué)研究中基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)重要手段之一。利用基因槍進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)不僅具有方便，快速，效率高等優(yōu)點(diǎn)，且對各種周期的細(xì)胞均能進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，不需要選擇活躍增殖期的細(xì)胞，這就避免了病毒載體的局

6、限性。1995年，WennHSun應(yīng)用基因槍將白細(xì)胞介素-6轉(zhuǎn)導(dǎo)入纖維肉瘤的鼠模型，明顯控制了腫瘤的生長。1996年，Rakhmilevich建立了腎癌，淋巴瘤，肉瘤，黑色素瘤等6種腫瘤鼠模型，并應(yīng)用基因槍分別進(jìn)行白細(xì)胞介素-12基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果表明，5種腫瘤的生長達(dá)到明顯抑制?；驑尩霓D(zhuǎn)基因治療研究表明，基因槍對于臨床腫瘤的vaccine的制備，以及直接臨床轉(zhuǎn)基因治療的應(yīng)用開辟了新途徑，具有顯著的臨床應(yīng)用價(jià)值。 本研究分以下三個(gè)

7、方面： 第一部分：突變體富集法檢測K-ras基因的第12密碼子點(diǎn)突變 目的：檢測三種胰腺癌細(xì)胞系K-ras基因第12密碼子的突變特征，為設(shè)計(jì)和合成突變特異性K-ras反義基因及siRNA提供依據(jù)，同時(shí)探索突變體富集法在檢測K-ras點(diǎn)基因突變中的應(yīng)用價(jià)值。 方法：本實(shí)驗(yàn)采用兩步巢式PCR，把K-ras基因第12密碼子的突變序列擴(kuò)增后酶切，酶切位點(diǎn)選擇在第12密碼子的第2個(gè)堿基，如果基因在這一位置發(fā)生突變，則無法酶

8、切，這樣突變的K-ras基因被保留，酶切產(chǎn)物再次擴(kuò)增，突變基因的特征被數(shù)十倍放大，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3(野生型)、AsPC-1(突變型)、MiaPaCa-2(突變型)進(jìn)行突變特征檢測，提高了K-ras基因突變的檢測率。對三種胰腺癌細(xì)胞系K-ras基因突變特征進(jìn)行DNA測序，并根據(jù)三種細(xì)胞系K-ras基因第12密碼子的突變特征，分別設(shè)計(jì)、合成突變特異性的正義和反義Oligo，另合成一對隨機(jī)Oligo。 結(jié)論：

9、以上結(jié)果表明，兩種突變型胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1和MiaPaCa-2都存在K-ras基因第12密碼子的點(diǎn)突變，野生型胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3無K-ras基因突變。同時(shí)表明突變體富集法是一種靈敏有效的檢測突變的方法，本實(shí)驗(yàn)不僅檢驗(yàn)了突變體富集法檢測突變的有效性，而且驗(yàn)證了其靈敏性。 第二部分：基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)突變特異性K-ras反義基因抑制胰腺癌細(xì)胞系K-ras基因表達(dá)及細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究基因槍法對金粒子介導(dǎo)的裸DN

10、A的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；從基因和蛋白水平探討基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)突變特異性K-ras反義基因?qū)σ认侔┩蛔冃蚄-ras基因的靜默作用，及對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用；為基因槍法轉(zhuǎn)導(dǎo)K-ras突變特異性反義基因治療胰腺癌提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 方法：a.應(yīng)用基因槍，將lacZ基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞系，培養(yǎng)12小時(shí)后用X-Gal染色，檢測基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)裸DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；確定基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)裸DNA的最佳條件；b.根據(jù)lacZ基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的最佳條件，用基因槍法把設(shè)計(jì)好的突變特異

11、性K-ras反義基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞系，培養(yǎng)24小時(shí)后提取總RNA和胞漿蛋白。c.應(yīng)用RT-PCR和Westernblot方法，分別從基因和蛋白水平，檢測基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)K-ras突變特異性反義基因?qū)σ认侔┘?xì)胞系突變型K-ras表達(dá)的抑制作用。d.做胰腺癌細(xì)胞系細(xì)胞爬片的K-rasp21蛋白免疫組化染色，從原位形態(tài)學(xué)角度探討K-ras突變特異性反義基因?qū)-ras基因表達(dá)的抑制。e.應(yīng)用CCK-8(cellcountingkit-8)活細(xì)胞計(jì)

12、數(shù)法，繪制轉(zhuǎn)基因前后細(xì)胞生長曲線，從細(xì)胞水平觀察K-ras突變特異性反義基因的抑瘤效果。 結(jié)論：a.基因槍法是有效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，可用于腫瘤的轉(zhuǎn)基因治療。b.作為轉(zhuǎn)基因研究的報(bào)告基因，1acZ基因可用于檢測基因槍對DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。c.突變特異性K-ras反義基因，可明顯下調(diào)突變型胰腺癌細(xì)胞系K-rasmRNA及K-rasp21蛋白表達(dá)。d.突變特異性K-ras反義基因可明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長，從而達(dá)到胰腺癌轉(zhuǎn)基因治療的目的。

13、 第三部分：基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)突變特異性K-rassiRNA抑制胰腺癌細(xì)胞系K-ras基因表達(dá)及細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究基因槍對金粒子介導(dǎo)小片段雙鏈siRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；從基因和蛋白水平探討基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)突變特異性K-rassiRNA對胰腺癌突變型K-ras基因表達(dá)的干擾作用，及對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用；為應(yīng)用基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)突變特異性K-rassiRNA，針對胰腺癌進(jìn)行基因治療，提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 方法：a.根據(jù)三種胰腺癌細(xì)胞系K

14、-ras基因測序，設(shè)計(jì)合成小片段雙鏈的突變特異性siRNA；b.應(yīng)用基因槍將標(biāo)記有熒光素FAM的siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞系，培養(yǎng)12小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察，確定基因槍對siRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果；c.應(yīng)用基因槍把突變特異性K-rassiRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞系，培養(yǎng)24小時(shí)后提取總RNA和胞漿蛋白；d.應(yīng)用RT-PCR和Westernblot方法，從基因和蛋白水平檢測基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)突變特異性K-rassiRNA對突變型K-ras基因表達(dá)的干擾作

15、用；e.行胰腺癌細(xì)胞系細(xì)胞爬片的K-rasp21蛋白免疫組化染色，從原位形態(tài)學(xué)角度，探討突變特異性K-rassiRNA對K-rasp21蛋白表達(dá)的抑制作用；f.應(yīng)用CCK-8(cellcountingkit-8)活細(xì)胞計(jì)數(shù)法，繪制轉(zhuǎn)基因前后細(xì)胞生長曲線，觀察突變特異性K-rassiRNA的抑瘤效果。 結(jié)論：a.基因槍可以有效地對小片段雙鏈siRNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)；b.突變特異性K-rassiRNA，可顯著下調(diào)胰腺癌細(xì)胞系突變型K

16、-rasmRNA及K-rasp21蛋白表達(dá)，并能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。 結(jié)論： 1胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1和MiaPaCa-2都具有K-ras基因第12密碼子的點(diǎn)突變，野生型胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3無K-ras基因突變。 2突變體富集法是一種靈敏有效的檢測基因突變的方法，其較高的敏感性和特異性有望彌補(bǔ)目前胰腺癌臨床診斷方法的不足。 3熒光素FAM標(biāo)記的小片段siRNA和lacZ基因可以作為腫瘤轉(zhuǎn)基因治療

17、研究的報(bào)告基因，檢測基因槍的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 4基因槍法可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)裸DNA和小片段雙鏈siRNA，可用于腫瘤的轉(zhuǎn)基因治療。 5突變特異性K-ras反義基因經(jīng)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)后，可以顯著下調(diào)K-ras基因突變型胰腺癌細(xì)胞系的K-rasmRNA及K-rasp21蛋白表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞生長，可用于胰腺癌的轉(zhuǎn)基因治療。 6突變特異性K-rassiRNA經(jīng)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)后可以顯著下調(diào)K-ras突變型胰腺癌細(xì)胞系的K-rasmRNA及K-