微生態(tài)制劑對(duì)非酒精性脂肪性肝炎c-Jun氨基末端激酶的影響.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一種無(wú)飲酒史或飲酒折合乙醇量男性每周＜140g,女性每周＜70g,以肝細(xì)胞彌散性脂肪變、氣球樣變和肝小葉炎癥和(或)中央靜脈、竇周膠原沉積等為臨床病理特點(diǎn)的慢性肝臟疾病[1],與肥胖、2型糖尿病、高血壓、高脂血癥等代謝綜合征關(guān)系密切,是代謝紊亂在肝臟的一種病理表現(xiàn)[2]。C-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,

2、JNK)是絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要成員之一,是介導(dǎo)細(xì)胞外刺激到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。在NASH的發(fā)生發(fā)展中,小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng),門靜脈內(nèi)毒素增加,通過(guò)Toll樣受體信號(hào)激活JNK,推測(cè)激活的JNK通過(guò)使轉(zhuǎn)錄因子c-jun磷酸化,激活下游炎癥相關(guān)基因釋放多種促炎因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα),導(dǎo)致肝組織炎癥的發(fā)生。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)成功建立NASH大

3、鼠模型,并應(yīng)用微生態(tài)制劑一雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌(金雙歧)灌胃干預(yù),研究非酒精性脂肪性肝炎發(fā)展過(guò)程中大鼠肝組織JNK、c-Jun的表達(dá)情況及其與肝組織病理改變、血清TNFα、血漿內(nèi)毒素表達(dá)水平等的關(guān)系,揭示JNK在NASH發(fā)病機(jī)制中的作用,為上述推測(cè)尋找部分證據(jù),從而為NASH的防治提供新的靶點(diǎn)。
　　 方法:選用健康清潔級(jí)3-4周齡雄性Wistar大鼠36只隨機(jī)分為以下六組:
　　 a 正常對(duì)照組6只:標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂

4、養(yǎng)1周后處死取材;
　　 b 高脂8周組6只:高脂飼料(83％普通飼料+2％膽固醇+10％豬油+5％玉米油)喂養(yǎng)8周;
　　 c 高脂12周組6只:高脂飼料(83％普通飼料+2％膽固醇+10％豬油+5％玉米油)喂養(yǎng)12周;
　　 d 高脂16周A組6只:高脂飼料(83％普通飼料+2％膽固醇+10％豬油+5％玉米油)喂養(yǎng)16周;
　　 e 高脂16周B組6只:高脂飼料(83％普通飼料+2％膽固醇+10％豬油

5、+5％玉米油)喂養(yǎng)16周,同時(shí)于12周時(shí)給予生理鹽水(與金雙歧干預(yù)劑量相同)灌胃4周;
　　 f 金雙歧干預(yù)組6只:高脂飼料(83％普通飼料+2％膽固醇+10％豬油+5％玉米油)喂養(yǎng)16周,并于12周時(shí)給予金雙歧(400mg/kg·d)灌胃4周;分別于造模0、8、12、16周末隔夜空腹、股動(dòng)脈放血處死,采集血清、血漿及大鼠肝組織,用于生化指標(biāo)檢測(cè)、普通病理、免疫組化染色和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcripti

6、on polymerase chain reaction,RT-PCR)測(cè)定。
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以-x±s表示,單因素方差分析前進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn),Least-Significant-Difference法進(jìn)行組間比較,雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析法。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果:
　　 1 大鼠的一般情況:正常對(duì)照組

7、大鼠精神狀態(tài)良好,食欲旺盛,皮毛柔亮;高脂組大鼠精神不振,食欲逐漸減退,皮毛欠柔亮,體重明顯增加;金雙歧干預(yù)組大鼠精神、食欲、皮毛及體重介于正常對(duì)照組與高脂16周B組之間。
　　 2 各組大鼠生化指標(biāo)、血漿內(nèi)毒素及血清TNFα水平變化:高脂8、12周、16周A組大鼠血清TC(2.792±0.312、3.455±0.324、3.865±0.183)、TG(0.693±0.115、0.855±0.104、1.018±0.133)、A

8、LT(63.435±15.853、85.087±14.250、102.948±12.264)、AST(94.553±7.087、118.442±12.838、153.435±13.346)、血漿內(nèi)毒素(0.815±0.107、1.327±0.209、2.157±0.238)、血清TNFα(11.157±2.703、21.333±4.077、28.223±2.885)水平均高于正常對(duì)照組(1.843±0.216、0.430±0.109、3

9、8.400±12.128、70.447±5.354、0.478±0.092、6.127±1.239),且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高(P值均＜0.01);金雙歧干預(yù)組上述各指標(biāo)(3.287±0.360、0.838±0.136、81.057±15.508、104.400±12.268、1.275±0.341、19.73±2.885)均較高脂16周B組(3.842±0.200、1.037±0.151、102.953±12.545、154.40

10、8±14.218、2.153±0.257、28.375±2.198)明顯下降(P值分別＜0.05、＜0.05、＜0.05、＜0.01、＜0.01、＜0.01)。
　　 3 肝組織病理學(xué)變化:肉眼觀,正常對(duì)照組大鼠肝臟呈紅褐色,質(zhì)地較軟,有光澤;高脂組大鼠肝臟體積逐漸增大,邊緣變鈍,顏色逐漸由紅褐色變?yōu)闇\黃色,切面油膩感;金雙歧干預(yù)組大鼠肝臟外觀介于正常對(duì)照組和高脂16周B組之間。光鏡下,HE染色可見(jiàn)正常對(duì)照組大鼠肝組織內(nèi)大小一致

11、的肝細(xì)胞圍繞肝小葉中央靜脈呈放射狀分布,肝索結(jié)構(gòu)完整;高脂8周大鼠肝組織中少量肝細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變,高脂12周大鼠肝組織顯示少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞的點(diǎn)狀壞死,高脂16周A、B組大鼠肝細(xì)胞均腫脹,炎癥程度加重,壞死范圍擴(kuò)大;金雙歧干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞氣球樣變、炎癥活動(dòng)度、壞死程度均較高脂16周B組明顯改善。Masson染色顯示正常對(duì)照組、高脂8周、12周組大鼠肝小葉中央靜脈及匯管區(qū)周圍均未見(jiàn)膠原纖維,高脂16周A、B組大鼠肝組織內(nèi)部分中央靜脈、

12、竇周及匯管區(qū)周圍可見(jiàn)膠原纖維沉積;金雙歧干預(yù)組大鼠肝組織纖維化程度較高脂16周B組明顯降低。SudanⅣ染色顯示正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色,無(wú)紅色脂滴;高脂8周、12周組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)逐漸出現(xiàn)紅染顆粒,且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增多;高脂16周A、B組大鼠均可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)充滿紅色脂滴,肝組織彌漫性脂肪變性;金雙歧干預(yù)組大鼠肝組織脂肪變程度較高脂16周B組顯著降低。
　　 4 肝組織JNK mRNA、c-Jun mRNA的表達(dá):RT

13、-PCR檢測(cè)在正常肝組織內(nèi)JNK mRNA、c-jun mRNA表達(dá)量較少(分別為0.319±0.027、0.299±0.039),隨著高脂飲食喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),JNK mRNA表達(dá)量(0.439±0.039、0.569±0.031、0.645±0.032)、c-jun mRNA表達(dá)量(0.385±0.063、0.525±0.074、0.611±0.033)均逐漸增加(P值均＜0.01)。金雙歧干預(yù)組JNK mRNA(0.439±0.05

14、7)、c-jun mRNA(0.367±0.062)表達(dá)較高脂16周B組(0.645±0.027、0.611±0.029)大鼠肝組織明顯減少(P值均＜0.01),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5 肝組織JNK、磷酸化JNK(phosphor-JN K,P-JNK)表達(dá):以P-JNK/JNK比值表示大鼠肝組織JNK的活性,肝組織免疫組化染色顯示大鼠肝組織JNK活性隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)(1.698±0.118、2.215±0.065、

15、2.376±0.047、2.617±0.064)逐漸增強(qiáng)(P＜0.01)。金雙歧干預(yù)組大鼠肝組織中P-JNK/JNK比值(2.279±0.067)較高脂16周B組(2.610±0.063)明顯減少(P＜0.01),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6 相關(guān)性分析:各組大鼠NASI-{模型肝組織JNK活性即P-JNK/JNK比值與血清1NF僅水平和血漿LPS水平呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.776(P＜0.01)、r=0.868(P

16、＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1 應(yīng)用高脂飲食飼養(yǎng)大鼠可以成功復(fù)制NASH大鼠模型,其中血清TNFα及血漿內(nèi)毒素在NASH發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。
　　 2 在NASH大鼠模型的肝組織中JNK活性隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng),下游轉(zhuǎn)錄因子c-jun磷酸化逐漸增多,與血清TNFα及血漿內(nèi)毒素水平呈正相關(guān),提示JNK信號(hào)通路參與肝臟炎癥的發(fā)生,在NASH的進(jìn)展中起重要作用。
　　 3 微生態(tài)制劑可補(bǔ)充腸道