抵抗素在非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatis,NASH)是以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪沉積和肝小葉內(nèi)炎癥為特征的慢性肝臟疾病,與肥胖、高血糖癥、高脂血癥、高血壓等胰島素抵抗相關(guān)性疾病并存。抵抗素(resistin)是一種脂肪細(xì)胞因子,高水平抵抗素可誘導(dǎo)NASH的發(fā)生,其機(jī)制可能與抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化、促進(jìn)炎癥因子的活化有關(guān)。研究非酒精性脂

2、肪性肝炎發(fā)展的不同階段大鼠肝組織抵抗素與AMPK的表達(dá)情況及血清抵抗素的表達(dá)水平及其與肝組織病理變化(脂肪變性、炎癥、纖維化)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)水平等的關(guān)系,揭示抵抗素在NASH發(fā)病機(jī)制中的作用及地位,為NASH的預(yù)防及治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 方法:選用雄性Wistar大鼠40只隨機(jī)分為正常對照組(10只)和模型組(30只)。正常對照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),模型組予以高脂飲食

3、喂養(yǎng)(標(biāo)準(zhǔn)飼料加2％膽固醇、10％豬油和5％玉米油)。分別于8、12、16周經(jīng)股動(dòng)脈放血處死,組織學(xué)染色證明NASH造模成功。
　　 留取血清,做血清生化指標(biāo)、TNFα和抵抗素水平監(jiān)測。留取肝右葉組織分為四部分,一部分用于快速冰凍切片,行SudanⅣ染色；一部分用10％的甲醛固定以做HE(haematoxylin-eosin,HE)染色及Masson染色；一部分用4％多聚甲醛固定用于抵抗素免疫組化染色；其余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于

4、-80℃冰箱,Western blot方法測定肝組織AMPKα的活性。
　　 用日本Olympus AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測血清膽固醇(cholesterol,TC),甘油三酯(triglyceride,TG),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT),天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase,AST)；用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimm

5、unosorbent assay,ELISA)測定血清TNFα和抵抗素水平。HE染色觀察肝組織普通病理變化；Masson染色觀察肝組織纖維化的程度；SudanⅣ染色,觀察肝細(xì)胞脂變程度；采用Power VisionTM二步法對肝組織進(jìn)行抵抗素免疫組化染色。用多功能病理圖象分析儀測定抵抗素表達(dá)面積百分比,每張片子取中央和四周五個(gè)區(qū)域,20倍物鏡下計(jì)算平均面密度(陽性面積與統(tǒng)計(jì)場面積百分比)。采用Western blot方法測定肝組織AMP

6、Kα以及磷酸化AMPKα(P-AMPKα)蛋白的表達(dá)水平,以P—AMPKα/AMPKα比值代表AMPKα的活性。
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果:
　　 1大鼠的一般情況:隨著造模時(shí)間的延長,正常對照組大鼠食欲佳,皮毛光滑,精神狀態(tài)好,體重逐漸增加。模型組大鼠自造模開始至12周食欲亦佳,皮毛亦光滑,體重增加明顯快于正常對照組,但在造模12周后逐漸精神萎靡,食欲減退,皮毛欠光滑,體重停

7、滯不增。
　　 2各組大鼠生化指標(biāo)及血清抵抗素、TNFα水平變化:8、12、16周模型組大鼠血清TC、TG、ALT、AST、TNFα水平以及抵抗素濃度均高于正常對照組(P<0.01,P<0.05),且隨著造模時(shí)間的延長逐漸升高(P<0.01)。
　　 3肝組織病理學(xué)變化:肉眼下,正常對照組大鼠肝臟呈紅褐色,明亮有光澤。模型組大鼠肝臟逐漸腫大,邊緣漸圓鈍,逐漸呈淺黃色或土黃色,切面油膩感增強(qiáng)。光鏡下HE染色可見正常對照組大

8、鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞大小一致,呈多邊形圍繞中央靜脈放射狀分布。造模8周大鼠肝組織顯示為單純性肝脂肪變性,造模12周大鼠肝組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞的浸潤和造型壞死,造模16周大鼠肝組織炎癥壞死程度加重。Masson染色顯示正常對照組、8周和12周模型組大鼠中央靜脈及匯管區(qū)未見明顯膠原纖維,16周模型組大鼠存在竇周及中央靜脈纖維化。SudanⅣ染色顯示正常對照組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)無紅染顆粒,隨造模時(shí)間的延長,肝細(xì)胞胞漿中逐漸出現(xiàn)紅色顆粒,且越來越

9、密集。
　　 4肝組織抵抗素表達(dá):肝組織免疫組化染色顯示正常大鼠肝組織幾乎不表達(dá)抵抗素,造模8周大鼠肝組織中央靜脈周圍可見少量抵抗素表達(dá),隨著造模時(shí)間的延長,肝組織抵抗素的表達(dá)明顯增加,以中央靜脈周圍最為顯著,匯管區(qū)周圍亦有少量表達(dá),定量分析顯示四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 5肝組織AMPKα的活性:Western blot測定肝細(xì)胞胞漿內(nèi)AMPKα和P—AMPKα蛋白表達(dá)水平,以P-AMPKα/AMP

10、Kα比值表示大鼠肝組織AMPKα的活性,結(jié)果顯示大鼠肝組織AMPKα活性隨造模時(shí)間的延長逐漸降低(P<0.01或P<0.05),且模型組均低于正常對照組(P<0.01或P<0.05),提示在NASH的進(jìn)展過程存在AMPKα活性的降低。
　　 結(jié)論:
　　 1應(yīng)用高脂飲食飼養(yǎng)大鼠可以成功復(fù)制NASH模型,其與NASH的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。
　　 2抵抗素在大鼠肝組織中的表達(dá)隨NASH的進(jìn)展程度逐漸增多,主要集中于中央