99mTc標記抗-TfR單克隆抗體介導的腫瘤靶向分子成像.pdf

1、目的：轉鐵蛋白受體（Transferrin Receptor，TfR）是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白受體，在肝癌等眾多惡性腫瘤細胞表面表達明顯上調，有望成為腫瘤靶向診斷和治療的新靶點。本研究以99mTc標記抗TfR單克隆抗體（99mTc-anti-TfR-mAb）為分子探針，通過荷瘤裸鼠的SPECT放射免疫顯像，評價探針的靶向性、體內(nèi)分布特性，為腫瘤的早期靶向診斷提供新思路。
　　方法：1.采用間接標記法，以NHS-HYNIC為雙功能螯合劑

2、、Tricine為協(xié)同配體進行anti-TfR-mAb的99mTc標記，以比色反應法測定聯(lián)接到anti-TfR-mAb上的HYNIC的數(shù)目，標記產(chǎn)物以PD10脫鹽柱純化，計算99mTc-anti-TfR-mAb的標記率，以ITLC-SG紙層析法測定放化純和體外穩(wěn)定性，以還原及非還原PAGE法鑒定99mTc-anti-TfR-mAb的分子量及完整性。
　　2.體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞，流式細胞術（FCM）檢測anti-TfR-m

3、Ab與HepG2細胞的結合情況。HepG2細胞接種于24孔板中，進行99mTc-anti-TfR-mAb的體外細胞結合實驗，包括：細胞飽和結合實驗、競爭抑制實驗及內(nèi)化實驗。
　　3.BALB/c-nu裸鼠右下肢皮下接種HepG2細胞，構建荷瘤裸鼠模型。尾靜脈注射99mTc-anti-TfR-mAb（37MBq，10μg），于相應時間點（1，3，6，9，12及24h）進行SPECT實驗組腫瘤顯像，對照組（阻斷）裸鼠先尾靜脈注射1mg

4、非標記的anti-TfR-mAb（100倍于99mTc-anti-TfR-mAb）再注射99mTc-anti-TfR-mAb。隨之于相應時間點處死動物，收集腫瘤及其它正常組織器官進行生物學分布實驗，并通過感興趣區(qū)（ROI）勾畫技術，計算腫瘤與對側肌肉組織的放射性計數(shù)T/M比值。顯像結束后，取腫瘤及肌肉組織以冰凍切片機制作快速冰凍切片，進行磷屏放射性自顯影成像，免疫熒光組織化學，進一步驗證腫瘤中TfR的表達。
　　結果：1.每分子a

5、nti-TfR-mAb聯(lián)接的HYNIC數(shù)目為5.2，99mTc-anti-TfR-mAb標記率為（87.5±3.8）％，放化純達（96.8±1.0）％以上，比活度是（7.02±1.13）MBq/μg，在正常人血清和生理鹽水中24h體外穩(wěn)定性分別為（93.14±2.00）％、（91.15±0.96）％。還原及非還原PAGE證實99mTc-anti-TfR-mAb與非標記anti-TfR-mAb的分子量一致，保持了蛋白的完整性。
　　

6、2.體外細胞飽和結合實驗結果表明，隨著99mTc-anti-TfR-mAb濃度的增加，細胞結合率逐漸增加，最后逐漸趨于飽和，HepG2細胞特異性結合的解離常數(shù)Kd值為5.91nM，最大結合容量Bmax為28.79×10-18mol/cell，每個細胞表面結合的TfR分子數(shù)為3.6×106個。競爭抑制細胞結合實驗證實，隨著非標記anti-TfR-mAb濃度倍數(shù)的增加，細胞結合率逐漸降低。細胞內(nèi)化實驗結果提示，當99mTc-anti-TfR

7、-mAb濃度為0.5nM時，細胞總結合率為（55.59±0.29）％、細胞內(nèi)化結合率為（39.15±0.76）％，細胞的內(nèi)化結合是總結合的（70.43±1.48）％。
　　3.生物學分布結果亦表明99mTc-anti-TfR-mAb在腫瘤內(nèi)的攝取隨時間延長逐漸增多，在血液、肝臟、肺等其他器官呈逐漸下降趨勢，24h腫瘤部位攝取達6.4±0.8％ID/g，明顯高于對側肌肉1.0±0.2％ID/g（P＜0.01，t=14.17）。荷瘤裸

8、鼠體內(nèi)顯像證實，1h時腫瘤組織隱約顯影，3h時腫瘤部位開始顯影清晰，隨時間延長，移植瘤部位放射性濃聚越來越明顯，至24h時移植瘤顯影最清晰，其腫瘤/肌肉（T/M）比值為11.4±1.6。對照組動物顯像表明（非標記anti-TfR-mAb預阻斷）各時間點腫瘤部位無明顯顯影，計數(shù)水平接近本底，24h的T/M比值僅為2.6±0.5（P＜0.01，t=﹣9.27），證實了99mTc-anti-TfR-mAb的特異性。腫瘤組織冰凍切片的放射自顯影