基于肝素酶單克隆抗體的腫瘤分子顯像及其抗腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的：
　　 腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因，是制約臨床治療效果的一種惡性生物學(xué)行為。目前針對(duì)腫瘤早期轉(zhuǎn)移的檢測(cè)沒(méi)有很好的方法，B 超、CT和MRI等是目前診斷腫瘤轉(zhuǎn)移的重要手段，但只能對(duì)一定大小的轉(zhuǎn)移瘤做出正確的診斷，且此時(shí)患者多發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。因此，尋找能夠早期診斷腫瘤轉(zhuǎn)移的技術(shù)日益重要。
　　 近年來(lái)，分子影像學(xué)(Molecular Imaging)的發(fā)展為腫瘤的早期診斷及治療開(kāi)辟了新的

2、領(lǐng)域。磁共振(MR)分子成像是分子影像學(xué)的重要領(lǐng)域之一，超順磁性分子探針的出現(xiàn)使其作為強(qiáng)大的信號(hào)擴(kuò)增系統(tǒng)，大大提高了MR 檢測(cè)靶向?qū)Ρ葎┑拿舾行?。?guó)內(nèi)外已有研究者采用順磁性離子復(fù)合物或磁性微粒結(jié)合單克隆抗體(mAbs)，選擇性的改變腫瘤的弛豫時(shí)間。目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原多具有組織特異性，如AFP、PSA、CEA等，以這些抗原制備的抗體只適用于表達(dá)該類抗原的腫瘤分子影像診斷。因此尋找腫瘤組織共同、特異性的靶點(diǎn)一直是腫瘤分子顯像的研究熱點(diǎn)。

3、
　　 肝素酶(Heparanase，Hpa)作為唯一能裂解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，EMC)內(nèi)蛋白聚糖主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulufate proteoglycans，HSPG)的內(nèi)源性糖苷內(nèi)切酶，在轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤中普遍存在，其表達(dá)水平的高低與腫瘤轉(zhuǎn)移及病人的預(yù)后密切相關(guān)。我們過(guò)去的研究表明，肝素酶可以作為一種腫瘤共有抗原用于腫瘤的免疫治療。那么，肝素酶是否可以作為一種腫瘤

4、共有抗原用于腫瘤的分子影像診斷？
　　 基于以上分析，本研究在前期成功制備基于肝素酶全長(zhǎng)Cdna 序列的單克隆抗體的基礎(chǔ)上，采用分子影像學(xué)技術(shù)，以納米金磁微粒(30nm)為分子顯像對(duì)比劑，肝素酶單克隆抗體為靶向載體，構(gòu)建HPA&GoldMag分子探針，用于體外、體內(nèi)分子顯像MR 研究，探討其應(yīng)用的可行性及其在腫瘤轉(zhuǎn)移早期診斷中的意義。同時(shí)研究了肝素酶抗體體外抗腫瘤的生物效應(yīng)，為肝素酶單克隆抗體在腫瘤分子影像診斷及其治療中的作用于

5、提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1、培養(yǎng)人肝癌HepG2、人胃癌SGC-7901、MKN45、人骨肉瘤U2OS、人乳腺癌MCF-7、人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，采用Western blot技術(shù)，以HepG2、SGC-7901、MKN45、SW480、U2OS、MCF-7細(xì)胞總蛋白為樣本，對(duì)已制備的7 號(hào)、11號(hào)、12號(hào)3株人肝素酶單克隆抗體進(jìn)行初步鑒定，篩選出能夠與肝素酶蛋白特異性結(jié)合的抗體，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

6、進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的抗體特異性。
　　 2、將納米金磁微粒作為MR 成像的對(duì)比劑，用其標(biāo)記篩選出的12 號(hào)肝素酶單克隆抗體構(gòu)建特異性MR分子探針HPA&GoldMag，通過(guò)原子力顯微鏡觀察納米金磁微粒偶聯(lián)抗體的能力，并通過(guò)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)探針與上述腫瘤細(xì)胞結(jié)合的活性和特異性；分離新鮮白細(xì)胞，與未標(biāo)記抗體和已標(biāo)記抗體的金磁微粒共同孵育，模擬體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬金磁微粒，探討影響白細(xì)胞吞噬金磁微粒的因素。

7、　　 3、應(yīng)用3.0T 磁共振掃描儀并建立MR 掃描序列，觀察不同濃度的納米金磁微粒MR 成像情況，體外探討探針應(yīng)用于各種腫瘤細(xì)胞成像的可行性；建立荷瘤裸鼠模型，對(duì)荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射HPA&GoldMag 探針，在注射前、注射后分別行MR 掃描，觀察探針對(duì)腫瘤組織T2WI信號(hào)的影響，探討其用于體內(nèi)腫瘤MR 成像的可行性。
　　 4、通過(guò)Transwell 體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察篩選出的肝素酶單克隆抗體對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用，探討其在

8、體外對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制效果。
　　 結(jié)果：
　　 1、通過(guò)Western-blot技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實(shí)12 號(hào)肝素酶單克隆抗體與肝素酶蛋白結(jié)合的特異性最好。
　　 2、成功構(gòu)建了HPA&GoldMag 特異性MR分子探針；原子力顯微鏡觀察標(biāo)記抗體前后的納米金磁微粒，未標(biāo)記抗體的納米金磁微粒粒徑大小約10個(gè)nm，標(biāo)記抗體后金磁微粒的粒徑變?yōu)?0nm；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)肝素酶陽(yáng)性的HepG2、SGC

9、-7901、MKN45、U2OS、SW480細(xì)胞株與HPA&GoldMag 特異性結(jié)合，均可見(jiàn)較強(qiáng)的紅色熒光，而在肝素酶弱陽(yáng)性的MCF-7細(xì)胞中紅色熒光最弱，正常小鼠IgG對(duì)照組各細(xì)胞系均為陰性；白細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，其吞噬金磁微粒量的多少與吞噬細(xì)胞濃度成正相關(guān)，并隨著吞噬細(xì)胞與金磁微粒共同孵育時(shí)間的增加其吞噬量隨之增加，大約在3h 左右吞噬量接近飽和；白細(xì)胞對(duì)30-50nm大小的金磁微粒吞噬量統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示相差不大，P＞0.053、體

10、外研究證實(shí)，HPA&GoldMag 探針與各腫瘤細(xì)胞共同孵育后行MR 掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，探針可顯著降低HepG2、SGC-7901、MKN45、SW480、U2OS細(xì)胞T2WI信號(hào)，略降低MCF-7細(xì)胞T2WI信號(hào)，而對(duì)HF細(xì)胞信號(hào)無(wú)顯著影響，對(duì)照組正常小鼠IgG偶聯(lián)的GoldMag對(duì)各腫瘤細(xì)胞MR信號(hào)均無(wú)顯著影響。
　　 4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在注射探針2 h后SGC-7901細(xì)胞荷瘤裸鼠腫瘤組織T2WI信號(hào)強(qiáng)度較注射探針前顯著降低(

11、p＜0.05)。
　　 5、Transwell 體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，12 號(hào)肝素酶單克隆抗體在100μg時(shí)作用于HepG2、SW480、SGC-7901、U2OS和MKN45細(xì)胞48小時(shí)后，其穿膜細(xì)胞數(shù)與正常小鼠IgG對(duì)照組相比明顯減少(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、篩選鑒定的12 號(hào)肝素酶單克隆抗體可以與肝素酶蛋白特異性結(jié)合，采用納米金磁標(biāo)記肝素酶單克隆抗體成功構(gòu)建成的HPA&Gol