單克隆抗體G250修飾的腫瘤細(xì)胞靶向基因載體研究.pdf

1、在基因治療中，非病毒載體因?yàn)榫哂邪踩愿摺⒚庖咴缘偷葍?yōu)點(diǎn)日益得到重視，而解決靶向性是非病毒載體的重要研究內(nèi)容。最常用的有效策略是以抗體和配體修飾非病毒載體，即將特定的抗體分子或配體分子與載體連接形成偶聯(lián)體，從而使DNA能靶向性地轉(zhuǎn)到表達(dá)特定抗原或受體的細(xì)胞內(nèi)。
　　 本研究以PEI為基因載體，以癌細(xì)胞高表達(dá)的G250抗原作為靶點(diǎn)，將G250單克隆抗體（G250mAb）和PEI偶聯(lián)，構(gòu)建了 G250 靶向非病毒基因載體，并進(jìn)行一

2、系列靶向轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，采用聚乙二醇（PEG）對(duì)靶向載體進(jìn)行進(jìn)一步修飾，改善其表面特性，提高非病毒基因載體在體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染效率。
　　 對(duì)小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，制備腹水；通過辛酸-硫酸銨沉淀法和蛋白A 瓊脂糖親和層析柱的方法純化 G250mAb，并經(jīng) SDS-PAGE 及免疫組織化學(xué)染色對(duì)抗體進(jìn)行鑒定。G250mAb 與 PEI 或 PEG 修飾的PEI 偶聯(lián)，偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)過葡聚糖 G-75 純化，分別得到 G250-PE

3、I 和 PEG-PEI-G250。進(jìn)行了凝膠阻滯、DNase I 酶解、激光光散射等實(shí)驗(yàn)。對(duì)表達(dá) G250 抗原的腎癌細(xì)胞（Ketr-3）、宮頸癌細(xì)胞（Hela）和不表達(dá) G250 抗原的肝癌細(xì)胞（HepG2）、腎癌細(xì)胞（ACHN）、血管平滑肌細(xì)胞（SMC）進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。此外還檢驗(yàn)了血清濃度對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率的影響。分別采用流式細(xì)胞儀和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定基因轉(zhuǎn)染效率。
　　 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明純化的G250mAb 具有結(jié)

4、合活性，可以與表達(dá)G250 抗原的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合。G250-PEI 和 PEG-PEI-G250 能夠與 DNA 形成納米復(fù)合物，粒徑分布較窄。PEI、PEG-PEI 經(jīng)過 G250mAb 修飾，顯著提高了載體的生物相容性。G250-PEI 對(duì) Hela 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別 19 倍于 SMC 和 2倍于HepG2。G250抗體對(duì)PEI修飾前后對(duì)Hela的轉(zhuǎn)染效率提高1倍，而對(duì)SMC、HepG2的轉(zhuǎn)染效率沒有明顯差別。這說明G250

5、mAb 的修飾使 PEI 獲得了基因轉(zhuǎn)染的靶向性。當(dāng)存在游離的G250mAb 時(shí)，G250-PEI 對(duì) Hela 的轉(zhuǎn)染效率由63.2±4.0％下降為4.0±1.0％。游離的G250mAb 對(duì) G250-PEI 和 PEI 轉(zhuǎn)染 SMC沒有明顯影響。這證明了基因載體的靶向性是通過 G250 抗原與抗體作用所介導(dǎo)的。血清對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率有一定影響，隨著血清濃度的增加，轉(zhuǎn)染效率也有所下降。但是，PEG和G250mAb修飾的PEI（PEG-PE