基于基因免疫抗hCGβ單克隆抗體的制備及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、構(gòu)建hCGD腫瘤基因疫苗的真核表達(dá)載體TR421-ehCGβ,可以在小鼠體內(nèi)誘生較強(qiáng)的特異性針對(duì)hCGβ的體液免疫反應(yīng),我們發(fā)現(xiàn)由該基因疫苗誘導(dǎo)的多克隆抗hCGβ血清可以在體外以補(bǔ)體非依賴的方式抑制王-IeLa、HepG2等腫瘤細(xì)胞的增殖,并且抗hCGβ抗體的抗增殖活性與腫瘤細(xì)胞表達(dá)hCGβ的高低密切相關(guān)。為了進(jìn)一步研究抗hCGβ抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,本課題利用TR421-hCGβ通過基因免疫手段免疫小鼠制備抗hCGβ單克隆抗

2、體,鑒定其生物學(xué)特性,并從中篩選具有抗腫瘤活性的單克隆抗體,分析其抗瘤效應(yīng),為基于hCGβ的腫瘤生物治療尋找新的途徑。
　　 第一部分 基于基因免疫抗hcGβ單克隆抗體的制備
　　 一、TR421-hCGβ基因免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答
　　 為制備抗hCGβ單克隆抗體,以TR421-0hCGβ經(jīng)肌肉免疫BALB/c小鼠。采血收集血清,檢測(cè)各組小鼠血清中抗hCGβ抗體,結(jié)果顯示:DNA初次免疫后第10天即

3、可檢測(cè)出抗hCGβ特異性抗體,追加免疫后抗體的水平顯著增高,特異性IgG滴度達(dá)1:104,在初次免疫后第4周再次增強(qiáng)免疫,抗體水平繼續(xù)升高,而且各免疫小鼠的抗體上升水平趨向一致,以上結(jié)果提示TR421-hCGβ基因免疫小鼠可誘生特異性體液免疫應(yīng)答。為下一步成功高效的進(jìn)行免疫小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、特異性分泌抗hCGβ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的建立
　　 為獲得特異性分泌抗hCGβ單克隆抗體的雜交

4、瘤細(xì)胞,取抗體效價(jià)最高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,在8塊96孔板中,共有340孔可見明顯雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng),融合率為45％。隨后,對(duì)已融合的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)一步檢測(cè)其是否分泌特異性抗hCGβ抗體,ELISA結(jié)果顯示:1A11、2E9、2G7、2H3、3C2、3F2、4C6、4G7、5C5、5D5、6H1、7A3、7A8、8D4、8F1初步檢測(cè)到有特應(yīng)性抗體產(chǎn)生。對(duì)篩選陽(yáng)性孔進(jìn)行有限稀釋法克隆和上清篩選,經(jīng)過三次亞克隆,共獲得9株分泌特異性

5、抗hCGβ單抗的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為1A11、2E9、2G7、3C2、5C6、5D5、6H1、7A8和8F1。染色體核型分析顯示所有獲得的雜交瘤細(xì)胞株染色體數(shù)目均在90條以上,將雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng),液氮凍存半年后復(fù)蘇,仍生長(zhǎng)良好,持續(xù)穩(wěn)定分泌抗體,證明9株雜交瘤細(xì)胞株已成功建立。
　　 三、抗hCGβ單克隆抗體的基本生物學(xué)特性鑒定
　　 為證明所獲得的單克隆抗體可以特異性識(shí)別hCGβ分子,用免疫印跡法(Wes

6、ternblot)鑒定抗體與hCGβ分子的特異性結(jié)合,結(jié)果顯示:9株單克隆抗體印染的PVDF膜在hCGβ的位置上出現(xiàn)了特異性的染色條帶,大小為30kD左右,與文獻(xiàn)報(bào)道的人hCGβ分子量相符合,證實(shí)獲得的單克隆抗體均可以特異性識(shí)別真核細(xì)胞表達(dá)的hCGβ蛋白。應(yīng)用間接免疫熒光證實(shí),9株單克隆抗體可以不同程度識(shí)別HeLa細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和HL60細(xì)胞上表達(dá)的膜型hCGβ分子。同時(shí)應(yīng)用間接ELISA確定其亞型,1A11、2E9、5D5和7A

7、8亞型為IgG1,2G7、3C2和6H1亞型為IgG2a,5C6和8目的亞型為IgG2b。
　　 第二部分 具有抗腫瘤活性的抗hCGβ單克隆抗體的篩選
　　 一、具有抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的抗hCGβ單克隆抗體的篩選
　　 在篩選具有抗腫瘤細(xì)胞增殖活性的單克隆抗體之前,我們對(duì)本實(shí)驗(yàn)中通過基因免疫獲得的多克隆抗血清進(jìn)行了功能鑒定。腫瘤細(xì)胞體外增殖結(jié)果顯示:TR421-hCGβ質(zhì)粒免疫血清(1:10稀釋)相對(duì)于正常血清對(duì)

8、HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.05)。滅活補(bǔ)體后的免疫血清對(duì)細(xì)胞增殖的仍然有較顯著的抑制作用,提示:抗hCGβ多克隆抗體對(duì)hCGβ陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用,且該作用不依賴補(bǔ)體。為檢測(cè)第一部分中制備的抗hCGβ單克隆抗體是否同樣抑制腫瘤細(xì)胞的體外增殖活性,我們通過檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn):6H1雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清與HeLa細(xì)胞共孵育48小時(shí)后,抗體處理組活細(xì)胞數(shù)占未處理組細(xì)胞數(shù)的

9、81.67±7.63％,提示6H1能夠抑制體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞的增殖。
　　 二、6H1單克隆抗體的制備純化及基本特性鑒定
　　 為進(jìn)一步對(duì)6H1單克隆抗體的抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行分析,我們采用體內(nèi)法收集小鼠腹水,制備高效價(jià)高純度的6H1單克隆抗體,腹水產(chǎn)生的陽(yáng)性率為80％,收獲量平均5ml/只,腹水抗體效價(jià)達(dá)1:106。腹水經(jīng)預(yù)處理后經(jīng)Protein G親和層析柱純化,用SDS-PAGE電泳鑒定純度達(dá)到90％以上。ELISA

10、鑒定純化6H1單克隆抗體可以特異性的結(jié)合hCG,同時(shí)與hLH或FSH無交叉反應(yīng)性。FACS檢測(cè)結(jié)果顯示:7株腫瘤細(xì)胞表達(dá)的膜結(jié)合型hCG可以不同程度的被純化6H1單抗識(shí)別并結(jié)合。間接免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí),6H1單抗能夠特異性的識(shí)別HeLa細(xì)胞表達(dá)的具有天然構(gòu)象的膜型hCGβ分子。
　　 第三部分 6H1單克隆抗體的抗腫瘤作用及其機(jī)制
　　 一、6H1在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖
　　 為觀察純化的抗hCGβ單克隆抗體

11、6H1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響,選擇天然高表達(dá)hCGβ的人HeLa細(xì)胞作為靶細(xì)胞,檢測(cè)純化6H1抗體孵育細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果證實(shí),6H1與HeLa細(xì)胞共孵育后顯示有明顯的細(xì)胞毒作用,并且呈劑量依賴性,當(dāng)6H1以濃度160μg/ml作用時(shí),HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)58％。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),6H1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)也趨明顯,呈時(shí)間依賴性。為進(jìn)一步觀察純化的抗hCGp單克隆抗體6Hl對(duì)其他表達(dá)hCGβ的腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響,選擇其他表達(dá)

12、hCGβ的人腫瘤細(xì)胞系HL-60、K562、HepG2、7721、PC-3以及SKOV-3作為靶細(xì)胞,以不表達(dá)hCGβ的ECV-304細(xì)胞為對(duì)照,檢測(cè)純化6H1抗體孵育細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示,除HeLa細(xì)胞外,HL-60、HepG2、7721和PC-3不同程度的對(duì)6H1單克隆抗體的細(xì)胞毒作用敏感,而K562和SKOV-3細(xì)胞活度沒有明顯變化。
　　 二、6H1在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證6Hl單克隆抗體對(duì)He

13、La細(xì)胞存在細(xì)胞毒作用,我們進(jìn)行裸鼠體內(nèi)腫瘤攻擊實(shí)驗(yàn)。將裸鼠皮下種植HeLa細(xì)胞腫瘤后進(jìn)行抗體干預(yù),每周測(cè)量腫瘤大小及并記錄荷瘤小鼠的生存周期的變化。結(jié)果顯示:荷瘤后第28天,6H1處理組腫瘤平均體積為1.76cm3,分別與對(duì)照抗體處理組3.41cm3、PBS處理組3.63cm3相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。同時(shí)監(jiān)測(cè)荷瘤小鼠的生存周期,PBS對(duì)照、對(duì)照抗體處理小鼠的平均生存期分別為30和37天,而6H1處理組的小鼠直至第48天

14、,仍有100％的存活率,小鼠平均生存期為77天。證明6H1單克隆抗體可以抑制體內(nèi)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 三、6H1單克隆抗體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡
　　 為探討6H1單克隆抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)的作用機(jī)制,相差顯微鏡下觀察6H1孵育48h的HeLa細(xì)胞形態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與6H1抗體共孵育的HeLa細(xì)胞與對(duì)照相比,部分細(xì)胞體積變小,表面無光澤,變圓,細(xì)胞表面突起多個(gè)小球狀的凋亡小體,提示:6H1能誘發(fā)hCGβ陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞

15、活力下降甚至凋亡,hCGβ陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞增殖活性下降可能與其有關(guān)。Hoechst 33258染色試驗(yàn)進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)上提示:6H1單克隆抗體可以誘導(dǎo)HeLa凋亡。收集6H1作用的HeLa細(xì)胞,抽取細(xì)胞總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組細(xì)胞基因組DNA相比,6H1作用的HeLa細(xì)胞DNA呈明顯的ladder,提示有凋亡細(xì)胞的存在。對(duì)6H1處理的HeLa細(xì)胞進(jìn)行Annexin V/PI雙染,FACS檢測(cè)結(jié)果顯示:6H1單克隆抗體

16、作用48小時(shí)后,顯示早期凋亡信號(hào)(Annexin V+/PI-)的HeLa細(xì)胞數(shù)量(9.46％)明顯多于對(duì)照抗體組(0.80％),晚期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI+)數(shù)量(4.55％)也明顯多于對(duì)照組(0.71％),壞死細(xì)胞(Annexin V+/PI+)數(shù)量也較對(duì)照組有部分增加。說明6H1單克隆抗體可以通過引起腫瘤細(xì)胞凋亡介導(dǎo)其抗腫瘤作用。
　　 綜上所述,本課題基于基因免疫原理,運(yùn)用經(jīng)典的B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得了9株

17、持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性抗hCGβ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,這些單克隆抗體可以特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表達(dá)的hCGβ分子。通過對(duì)這些單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)功能的篩選,我們發(fā)現(xiàn)6H1單克隆抗體可以在體外抑制HeLa細(xì)胞的增殖,通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明,6H1對(duì)hCGβ陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞株有比較顯著的細(xì)胞毒作用,并具有體內(nèi)抑瘤活性。通過對(duì)凋亡相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)測(cè),我們證明6H1可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮其體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)。本研究為今后hCGβ表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤的防治提供