抗人DR5單克隆抗體的制備及抗腫瘤作用.pdf

1、背景： TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是屬于能夠誘導(dǎo)細胞凋亡的TNF超家族成員。作為二型跨膜蛋白，它能夠引起包括腫瘤細胞及一些轉(zhuǎn)化細胞的凋亡。而DR5是TRAIL的重要受體之一，在TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡中起著重要的作用。DR5或DR4特異性的抗體的作用將優(yōu)于外源性TRAIL的應(yīng)用，因為一些腫瘤細胞的表面不僅有DR5/DR4，而且還有誘騙受體的表達，使TRAIL的作用發(fā)揮受

2、到限制，但是特異性的DR5抗體不會影響它的凋亡誘導(dǎo)作用。針對能夠特異的通過和死亡受體結(jié)合而向下傳遞凋亡信號，引起靶細胞的凋亡的特點，DR5抗體克服了TRAIL的不良作用，成為理想的候選者。盡管國內(nèi)外已經(jīng)制備出一些DR5的抗體，其中有一種抗體已經(jīng)進入臨床一期的實驗階段，但是，至今仍沒有上市的有效藥物。 目的： 對已獲得的小鼠抗人DR5單克隆抗體的特異性、抗體亞型以及生物學(xué)功能進行鑒定，并對抗體通過DR5進一步誘導(dǎo)腫瘤細胞凋

3、亡的機制進行探討。 方法： 將表達載體pET30a/DR5轉(zhuǎn)化到BL21，經(jīng)0.1mM IPTG誘導(dǎo)表達，鎳柱純化后，經(jīng)SDS-PAGE、Western--blot和蛋白質(zhì)譜分析鑒定抗原蛋白。以表達純化的DR5抗原蛋白免疫Balb/c小鼠，經(jīng)融合、篩選及反復(fù)克隆化為基礎(chǔ)(抗體制備過程由天廣實生物技術(shù)有限公司完成)，對獲得的抗人DR5單抗-WD1進行鑒定，Western Blot和FACS方法檢測單抗WD1與重組的DR5及

4、膜型DR5的結(jié)合。MTT法檢測WD1對幾種細胞的生長抑制作用。吉姆薩染色、Annexin v/PI雙染檢測WD1對Jurkat的凋亡作用。通過將pcDNA3.1/DR4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞以FACS檢測WD1與DR4的交叉反應(yīng)性。通過RT-PCR的方法釣取Jurkat和Daudi細胞的DR5胞內(nèi)段蛋白序列分析細胞的突變情況，做DISC免疫沉淀實驗分析抗體與DR5激活的關(guān)系。 結(jié)果： 原核表達載體在BL21中實現(xiàn)

5、大量表達，經(jīng)SDS--PAGE和蛋白質(zhì)譜分析鑒定，在19kD處有一明顯的誘導(dǎo)表達帶，其分子量大小與預(yù)期相符。Western-blot分析表明，該表達蛋白帶可被抗人DR5抗體特異性的識別。為單抗的鑒定奠定了基礎(chǔ)。成功制備了一株活性較好的抗DR5單克隆抗體-WD1。亞型分析WD1的重鏈為IgG1型，輕鏈為K型。WD1可識別19KD的DR5單體蛋白，而且也識別37KD的DR5二聚體蛋白。FACS分析結(jié)果提示W(wǎng)Dl可與多種細胞的膜型DR5分子特

6、異性結(jié)合，而與DR4<'+>/293T細胞無交叉反應(yīng)。MTT結(jié)果表明WD1對Jurkat、Molt-4細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性；細胞形態(tài)學(xué)(吉姆薩染色)和FACS (Annexin V/PI)分析結(jié)果證實WD1對Jurkat細胞具有誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。 通過RT-PCR的方法釣取Jurkat和Daudi細胞的DR5胞內(nèi)段蛋白序列，經(jīng)比對測序結(jié)果，兩種細胞均與文獻報道的DR5胞內(nèi)段序列完全一致，這樣就證實了細胞系本身未發(fā)生突變，