不同劑量白藜蘆醇對(duì)高脂模型小鼠脂代謝及相關(guān)基因SIRT1，LXR-α和ABCA1影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來(lái),心腦血管疾病已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的重大疾病。引起心腦血管疾病的病因目前尚不完全清楚,但血脂異常是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素已經(jīng)得到了多數(shù)研究的支持。因此探討脂代謝機(jī)制對(duì)預(yù)防心腦血管疾病有著積極的應(yīng)用及科學(xué)意義。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)高脂飲食的法國(guó)人卻伴隨著較低的心腦血管發(fā)病率,這與飲用紅葡萄酒有關(guān)。白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)是廣泛存在于葡萄、花生和多種植物中的一種多酚類化合物,已在72種植物中被發(fā)現(xiàn),

2、以中藥虎杖中含量最高。研究表明,RSV具有降低血脂、抗血小板聚集、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、提高免疫功能等生理活性,已成為人們研究的熱點(diǎn)。多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為RSV能夠提高SIRT1酶活性并提高乙?；孜锏挠H和力,是SIRT1的功能激活劑。
　　 沉默信息調(diào)節(jié)因子(Silent information regulator 1,SIRT1)是哺乳動(dòng)物中與SIR2(Silent information regulator 2,SIR2)同源的基因,

3、SIR2是一類首先在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的通過(guò)染色體沉默機(jī)制和細(xì)胞能量代謝機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞壽命的重要基因。SIRT1編碼的核蛋白通過(guò)去乙?；饔脜⑴c多種新陳代謝活動(dòng),通過(guò)多種組蛋白和非組蛋白來(lái)完成不同的功能,其中肝X受體(Liver X receptors,LXRs)是與膽固醇,甘油三酯和糖代謝密切相關(guān)的一類具有基因調(diào)控作用的核受體。膽固醇的一些代謝產(chǎn)物如羥基固醇24s,25-環(huán)氧膽固醇等是其內(nèi)源的激活配體。鑒于SIRT1對(duì)于LXRs的調(diào)節(jié)作用,如

4、果能夠通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1活性間接調(diào)節(jié)LXRs的表達(dá),則可以對(duì)脂代謝起到良好的調(diào)節(jié)效果。SIRT1通過(guò)LXRs影響膽固醇代謝的具體機(jī)制研究國(guó)內(nèi)尚未見到相關(guān)報(bào)道。
　　 本研究采用不同劑量的白藜蘆醇對(duì)高脂模型小鼠進(jìn)行干預(yù),觀察其血脂和氧化應(yīng)激水平的變化,并研究SIRT1,LXR-α和ABCA1基因在mRNA水平的表達(dá)情況,以探討RSV是否能夠提高SIRT1的活性,并間接調(diào)節(jié)LXRs及其下游靶基因的表達(dá)。
　　 材料與方法：<

5、br>　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
　　 50只8w齡健康雄性昆明種小鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后,根據(jù)體重隨機(jī)抽取10只作為基礎(chǔ)組,繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；其余40只給予高脂高膽固醇飼料(總脂肪含量為10％,膽固醇含量為1％),4w后,禁食12h,由其內(nèi)眥靜脈采血0.5ml左右,離心分離血清,測(cè)定總膽固醇(Total cholesterol,TC)水平,其中高脂飼料組按TC水平,隨機(jī)分為4組:高脂組,白藜蘆醇低5meal(kg·bw·d)

6、、中22.5mg/(kg·bw·d)、高45mg/(kg·bw·d)劑量組。此后進(jìn)行干預(yù),基礎(chǔ)組和高脂組均灌胃羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose solution,CMC)0.5％溶液,白藜蘆醇低、中、高劑量組分別給予不同劑量的白藜蘆醇羧甲基纖維素溶液。干預(yù)期間,小鼠自由攝食飲水,每周稱2次體重,根據(jù)體重調(diào)整灌胃劑量,干預(yù)時(shí)間為8w。
　　 二、測(cè)定指標(biāo)及方法
　　 (一)血脂
　　 在

7、干預(yù)期末,各組取10 只小鼠禁食12h后,乙醚麻醉下,摘眼球取血,離心分離血清,按照試劑盒說(shuō)明測(cè)量下列指標(biāo):TC、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)。
　　 (二)氧化應(yīng)激指標(biāo)
　　 取保存血清和適量肝

8、組織,勻漿,測(cè)量氧化應(yīng)激指標(biāo)；按照試劑盒說(shuō)明測(cè)量下列指標(biāo):總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)。
　　 (三)肝臟病理學(xué)觀察
　　 大體觀察 分離肝臟,觀察其形態(tài)、顏色和質(zhì)地變化；

9、計(jì)算肝指數(shù):肝指數(shù)(％)=肝重(g)/體重(g)×100。HE切片鏡下觀察。
　　 (四)小鼠肝臟SIRT1、LXR-α和ABCA1 mRNA的表達(dá)量
　　 用Trizol試劑提取肝組織中的總RNA,將其溶于Erasol水中,紫外分光光度計(jì)測(cè)定此RNA溶液的A2260/A280比值。用RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增各組小鼠肝臟中SIRT1 mRNA、LXR-αmRNA和ABCA1 mRNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳

10、,并與Marker比較之后,在電泳凝膠成像分析儀上凝膠成像,用Scion Image4.03軟件進(jìn)行灰度分析,以灰度值表示電泳帶強(qiáng)弱,以與內(nèi)對(duì)照β-actin的比值作為目的基因表達(dá)的相對(duì)含量。
　　 三、數(shù)據(jù)處理
　　 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(x)±s表示,用方差分析比較各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,組間兩兩比較用LSD法。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。
　　 結(jié)果
　　 一、動(dòng)物一般狀況及體重

11、變化
　　 實(shí)驗(yàn)期間,各組小鼠一般狀況良好,生長(zhǎng)發(fā)育未見異常表現(xiàn)。各組小鼠干預(yù)前后,RSV低劑量組增重最多,但各組間比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 二、肝臟病理變化
　　 比較各組肝指數(shù)值,可得高脂組高于其他組(P<0.05)。觀察肝臟大體可見基礎(chǔ)組小鼠肝臟形態(tài)、質(zhì)地、顏色均正常；高脂組的肝臟體積增大,外形飽滿圓鈍,色澤灰黃,切面油膩,質(zhì)地較脆；而RSV各組小鼠肝臟體積略增大,邊緣稍鈍,暗紅色,接近基礎(chǔ)組

12、。
　　 觀察病理切片可見:基礎(chǔ)組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常,無(wú)脂肪變性,細(xì)胞排列緊密。高脂組小鼠的肝臟中有少數(shù)肝細(xì)胞發(fā)生了脂肪變,但尚未達(dá)到脂肪肝的程度。不同劑量的RSV組小鼠均有少數(shù)肝細(xì)胞發(fā)生了脂肪變,其中中劑量組肝細(xì)胞脂肪變性較少,細(xì)胞排列較緊密。
　　 三、血脂水平
　　 在血清TC水平上,高脂組明顯高于基礎(chǔ)組(P<0.05)；各組血清LDL-C水平,高脂組明顯高于基礎(chǔ)組(P<0.05)；RSV中劑量組明顯低于高

13、脂組(P<0.05)。各組HDL-C水平,TG水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 四、抗氧化水平
　　 比較各組血清抗氧化水平,高脂組血清MDA水平明顯高于其他各組,RSV各組均降低了MDA水平,其中RSV中劑量組明顯低于高脂組(P<0.05)。各組血清GSH-Px水平,高脂組明顯低于基礎(chǔ)組,RSV中劑量組明顯高于高脂組(P<0.05)。比較各組血清SOD,T-AOC水平,各組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　

14、　 比較各組肝臟抗氧化水平,RSV各組MDA水平均有所降低,其中RSV中劑量組明顯低于高脂組(P<0.05)。比較各組肝臟GSH-Px水平,高脂組,RSV低劑量組,RSV高劑量組均明顯低于基礎(chǔ)組(P<0.05)。比較各組肝臟SOD,T-AOC水平,各組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 五、SITT1,LXR-α和ABCA1的mRNA表達(dá)水平
　　 各組間SIRT1,LXR和ABCA1的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異(

15、P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、5mg/(kg·bw·d)RSV能夠降低高脂模型小鼠血清TC水平；22.5mg/(kg·bw·d)RSV能夠降低高脂模型小鼠血清LDL-C水平。
　　 2、各劑量組RSV均能降低MDA水平,其中22.5mg/(kg·bw·d)RSV能夠提高高脂模型小鼠GSH-Px酶活力。
　　 3、本研究條件下,未觀察到RSV對(duì)SIRT1的激活作用,以及間接調(diào)節(jié)LXR-α及其下游靶