AMPK和SIRT-1參與定時(shí)高脂飲食對小鼠肝臟生物鐘基因的影響研究.pdf

1、目的：
　　觀察定時(shí)高脂飲食對高脂性脂肪肝小鼠肝臟生物鐘基因及其脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，并探討其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　選用雄性昆明種小鼠，嚴(yán)格控制明/暗條件（8:00-20:00/20:00-次日8:00），以晚上（19:00）定時(shí)給予高脂飲食6周復(fù)制高脂性脂肪肝小鼠模型，然后分別在不同授時(shí)時(shí)相（8:00、12:00、16:00、20:00、24:00和4:00）處置實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用比色法測定肝組織中總膽固醇（

2、total cholesterol，TC）、甘油三酯(triglycerides，TG)、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)和氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)含量；用光鏡檢查肝組織的形態(tài)學(xué)變化；用ELISA法測定肝組織中AMP依賴的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）含量；用Real-time PCR法

3、檢測肝組織中生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1-2和Cry1-2，以及過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)α、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子-1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1)α、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，

4、LPL）、二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)2、乙酰輔酶 A羧化酶-1(acetyl-CoA carboxylase-1，ACC-1)α、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1)和煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT）mRNA表達(dá)的情況；用W

5、estern blot法測定肝組織中AMPK、p-AMPK、沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(silent information regulator oftranscription1，SIRT-1)、Cry2和Per2的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　在晚上定時(shí)給予高脂飲食6周后，可見小鼠肝組織中有大量的脂質(zhì)空泡形成，測得的肝組織中TC、TG和FFA含量在不同時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的升高，而且與正常對照組相比，TC含量的變化較平緩，但在光

6、照期間有明顯的幅度增加；TG含量亦以光照期間升高幅度更為明顯，于12:00達(dá)到峰值；FFA含量則未見有明顯的節(jié)律改變。Real-time PCR測定結(jié)果顯示，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因PPARα、PGC-1α、LPL、DGAT2、ACC-1α和CPT-1 mRNA表達(dá)在節(jié)律和/或振幅上有明顯改變，而肝臟生物鐘基因Clock、Bmal1、Per1-2和Cry2 mRNA表達(dá)的量也有明顯的改變。Western blot測得Per2和Cry2蛋白表達(dá)在

7、振幅上也發(fā)生了明顯的變化。
　　進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，晚上定時(shí)給予高脂飲食6周后，小鼠肝組織中平均 AMPK和p-AMPK蛋白表達(dá)均降低。與正常對照組相比，高脂飲食組的AMPK峰值延遲了8 h，振幅在12:00和20:00有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而p-AMPK在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與正常對照組比較，則在12:00明顯降低，在20:00顯著增加。晚上定時(shí)高脂飲食也可以使肝組織中NAMPT mRNA、NAD+含量和SIRT-1蛋白表達(dá)在節(jié)律和/或振