白藜蘆醇改善高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗和肝臟脂毒性機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為四部分： 第一部分、大鼠正糖-高胰島素鉗夾術(shù)的改進(jìn) 目的：在經(jīng)典正糖-高胰島素鉗夾術(shù)基礎(chǔ)上對插管技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，利用尾動靜脈插管技術(shù)實(shí)施清醒狀態(tài)下大鼠高胰島素-正糖鉗夾實(shí)驗(yàn)并對該技術(shù)進(jìn)行評價。 方法：正常喂養(yǎng)和高脂喂養(yǎng)Wistar大鼠各5只，喂養(yǎng)4周后，清醒狀態(tài)下鼠尾根局部麻醉，分別尾動靜脈插管，由尾靜脈輸入胰島素(速度O 25u/kg·h)和葡萄糖，尾動脈采血，進(jìn)行高胰島素-正糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果

2、：尾動靜脈插管術(shù)后大鼠血糖在正常范圍內(nèi)，術(shù)后血糖無明顯波動；高脂喂養(yǎng)組大鼠的葡萄糖輸注率顯著低于對照組(P<0.01)，表明高脂喂養(yǎng)的大鼠有胰島素抵抗。 結(jié)論：尾動靜脈插管技術(shù)基礎(chǔ)上的高胰島素-正糖鉗夾實(shí)驗(yàn)是可行的，較傳統(tǒng)插管技術(shù)，具有簡便易行、縮短實(shí)驗(yàn)周期、大鼠死亡率低的優(yōu)點(diǎn)。 第二部分、白藜蘆醇改善高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗、脂肪肝及其機(jī)制的研究 目的：觀察白藜蘆醇是否能夠改善高脂喂養(yǎng)所導(dǎo)致大鼠的胰島素抵抗和非酒

3、精性脂肪肝(NAFLD)并探討其機(jī)制。 方法：急性實(shí)驗(yàn)：10只Wistar大鼠分成兩組(每組5只)，對照組和白藜蘆醇處理組，處理組白藜蘆醇(100mg／kg.day)灌胃，對照組生理鹽水灌胃，4小時后均處死，檢測肝臟內(nèi)AMPK磷酸化水平。慢性實(shí)驗(yàn)：30只Wistar大鼠平均分為3組(每組10只)：正常對照組(標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng))，高脂組(高脂飼料喂養(yǎng))，和白藜蘆醇組，其中白藜蘆醇組全程高脂飼料喂養(yǎng)，并從第7周開始用白藜蘆醇干預(yù)治療(1

4、00mg／kg.day)，各組均喂養(yǎng)16周。以正糖-高胰島素鉗夾技術(shù)評價大鼠IR,肝臟石蠟切片HE染色觀察病理學(xué)改變，肝臟冰凍切片油紅O染色觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積狀況，WestemBlot免疫印跡檢測肝臟內(nèi)AMPK磷酸化水平，RT-PCR檢測肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS)的mRNA基因表達(dá)。 結(jié)果：急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：白藜蘆醇干預(yù)組肝臟組織內(nèi)AMPK磷酸化水平增高到對照組的164．2％；慢性實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果：高脂喂養(yǎng)組大鼠與對照組相比，內(nèi)臟脂肪指數(shù)、肝指數(shù)增高(P<0．05)，空腹胰島素水平增高、葡萄糖輸注率下降(P<0.01)，光鏡下肝臟出現(xiàn)明顯脂肪變性，肝組織內(nèi)AMPK磷酸化水平降低到對照組的45．8％(P<0．01)，同時脂質(zhì)合成基因SREBP-1c和FAS的mRNA表達(dá)量顯著增多；白藜蘆醇治療后的大鼠，內(nèi)臟脂肪含量顯著下降(P<0．01)，空腹胰島素水平降低、葡萄糖輸注率明顯增加(P<0.01)，光鏡下的肝臟脂肪變性得到明顯

6、改善，肝組織內(nèi)的AMPK磷酸化水平提高到對照組的70．2％(P<0.05)，與此同時脂質(zhì)合成基因SREBP-1c和FAS的mRNA表達(dá)量降低。 結(jié)論：白藜蘆醇可以在體內(nèi)促進(jìn)肝臟內(nèi)AMPK活性；白藜蘆醇治療可以改善高脂喂養(yǎng)大鼠的IR同時減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積從而改善脂肪肝，其機(jī)制是通過激活A(yù)MPK而抑制下游脂質(zhì)合成途徑。 第三部分、白藜芒醇可通過激活A(yù)MPK途徑減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積 目的：觀察白藜蘆醇是否能夠直接作用于

7、肝細(xì)胞而減少肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積，并深入探討其機(jī)制。 方法：HepG2細(xì)胞種植于6空板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞融合到80％單層貼壁細(xì)胞時血清饑餓過夜后，分別加入含0μM、10μM、25μM、50μM的白藜蘆醇的低糖DMEM培養(yǎng)基孵育6小時和24小時后提取細(xì)胞蛋白檢測細(xì)胞內(nèi)AMPK水平；將HepG2培養(yǎng)于含25mmol／L葡萄糖和10mm／L的胰島素培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24小時誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪變性模型，然后以50μM白藜蘆醇濃度干預(yù)脂肪變性模型細(xì)胞24小時

8、，提取蛋白后WesternBlot免疫印跡檢測細(xì)胞內(nèi)AMPK磷酸化水平；Trizol提取細(xì)胞內(nèi)mRNA檢測固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAs)的基因表達(dá)水平，同時油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和提取細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)檢測細(xì)胞內(nèi)TG含量。 結(jié)果：白藜蘆醇呈劑量、時司依賴性促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)AMPKα磷酸化。HepG2細(xì)胞脂肪變性模型組出現(xiàn)明顯的紅色脂滴聚集(油紅O染色顯示)，細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著高于對照組(P<0.0

9、1)，AMPK磷酸化水平降低到對照組的33 5％，SREBP-1c、FAS基因表達(dá)量分別增高到對照組的182％和167％；白藜蘆醇處理組HepG2油紅O染色和細(xì)胞內(nèi)TG定量均顯示脂肪變性得到明顯改善，AMPK磷酸化水平恢復(fù)到對照組的72 6％，而SREBP-1c和FAs的基因表達(dá)量也顯著下降。 結(jié)論：白藜蘆醇可以在體外提高肝細(xì)胞內(nèi)AMPK活性；白藜蘆醇可以直接作用于肝細(xì)胞減少肝細(xì)胞內(nèi)TG沉積，其機(jī)制是激活A(yù)MPK后抑制下游的SR

10、EBP-1c、FAS的基因表達(dá)進(jìn)而抑制脂質(zhì)合成。 第四部分、白藜芒醇改善高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠氧化應(yīng)激 目的：觀察白藜蘆醇是否能夠減輕高脂誘導(dǎo)IR模型大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激，并探討氧化應(yīng)激與IR關(guān)系。 方法：動物造模分組同本文第二部分，高胰島素-正糖鉗夾術(shù)檢測胰島素敏感性，試劑盒分別檢測血清標(biāo)本羥自由基、MDA水平和SOD活性，ELISA法檢測血清TNF-α濃度。 結(jié)果：模型組大鼠血清羥自由基、MDA、TNF-