Sirt1-FOXO1信號(hào)通路對肝細(xì)胞脂代謝的影響及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、目的：①建立細(xì)胞脂肪變性模型，并且了解白藜蘆醇是否可以改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積狀態(tài)；②如果可以改善，進(jìn)一步探索可能的分子機(jī)制，白藜蘆醇是否可以抑制促脂肪合成的關(guān)鍵因子SREBP1 的表達(dá)，Sirt1-FOXO1信號(hào)通路是否參與了調(diào)控過程，為白藜蘆醇治療非酒精性脂肪肝提供分子學(xué)依據(jù)。
　　 方法：⑴四氮唑藍(lán)比色分析法（MTT法）確定軟脂酸鈉與白藜蘆醇的安全用藥范圍.⑵用軟脂酸鈉誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，油紅O染色法定性與定量檢測

2、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量是否明顯增加，確定建立細(xì)胞脂肪變模型。⑶設(shè)立對照組(Con)、白藜蘆醇組(Res)、高脂組(HF)、高脂+白藜蘆醇組(HF+Res)、CR組與CR+白藜蘆醇組(CR+Res)，檢測白藜蘆醇與CR是否可以使細(xì)胞內(nèi)脂滴有所減少。⑷如果白藜蘆醇可以改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的狀態(tài)，那么，用RT-PCR與Western blot 檢測SREBP1表達(dá)的變化，并且用免疫熒光的方法間接評估SREBP1的功能.⑸用RT-PCR 與Western

3、 blot檢測Sirt1與FOXO1表達(dá)的變化，并且用免疫熒光的方法間接評估FOXO1的功能，分析SREBP1表達(dá)變化與Sirt1、FOXO1的表達(dá)變化之間，是否存在一定的聯(lián)系。
　　 結(jié)果：①M(fèi)TT檢測結(jié)果表明，軟脂酸鈉的濃度>0.4mM時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降，我們選擇0.05-0.3mM作為藥物的安全用藥范圍；白藜蘆醇的濃度>100μM 時(shí),細(xì)胞活力明顯下降，因此，我們選擇10-50μM作為藥物的安全用藥范圍。②油紅O染色定性

4、與定量測定的結(jié)果表明，0.2mM的軟脂酸鈉可以引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯堆積，這一濃度將作用為建立細(xì)胞模型的作用濃度。③白藜蘆醇可以促進(jìn)Sirt1 的表達(dá)，呈劑量依賴效應(yīng)，40μM 的白藜蘆醇可以引起Sirt1 蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)（ P<0.05），這一濃度將作為白藜蘆醇的作用濃度。④脂質(zhì)定量測定表明，高脂組細(xì)胞內(nèi)脂肪積累顯著多于對照組（ P<0.05）；高脂＋白藜蘆醇組細(xì)胞內(nèi)脂肪積累顯著少于高脂組（ P<0.05）。這表明，白藜蘆醇可以使脂肪

5、變性細(xì)胞內(nèi)脂滴的量減少。⑤RT-PCR 和Western blotting 檢測結(jié)果表明，軟脂酸鈉可以在mRNA和蛋白兩個(gè)水平上誘導(dǎo)SREBP1 的表達(dá)，而白藜蘆醇可以在一定程度上抑制軟脂酸鈉的這一效應(yīng)；另外，與對照組相比，CR組SREBP1的表達(dá)是減少的，這也證實(shí)了白藜蘆醇可以模仿CR 的效應(yīng)。⑥免疫熒光的結(jié)果表明，軟脂酸鈉可以促進(jìn)SREBP1 從細(xì)胞胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，而白藜蘆醇則可以抑制軟脂酸鈉的這一作用；在CR條件下，SREBP

6、1也是主要位于細(xì)胞的胞漿中。⑦PT-PCR 和Western blotting 檢測結(jié)果均表明，白藜蘆醇模仿CR的效應(yīng)，增加Sirt1與FOXO1的表達(dá)。另外，免疫熒光檢測結(jié)果表明，白藜蘆醇和CR都可以使FOXO1的活性增強(qiáng)，與PT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：白藜蘆醇可以改善細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積狀態(tài)，分子機(jī)制可能是白藜蘆醇通過Sirt1-FOXO1信號(hào)通路，抑制SREBP1的表達(dá)。我們的研究將