胰島素血糖依賴性和非依賴性心肌保護(hù)作用及抗腎上腺素能心肌保護(hù)新機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　“葡萄糖-鉀-胰島素”（GIK）極化液作為輔助治療措施用于急性心肌缺血（AMI）的治療已有近半個(gè)世紀(jì)的歷史，基于動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)研究均多次證實(shí)GIK及其關(guān)鍵成分胰島素在保護(hù)缺血心肌方面的有益作用。然而，GIK應(yīng)用于AMI治療的臨床試驗(yàn)結(jié)果不一，圍繞GIK臨床有效性及其作用機(jī)制的諸多爭(zhēng)議性問(wèn)題，至今在基礎(chǔ)和臨床研究領(lǐng)域尚未有確鑿的實(shí)驗(yàn)依據(jù)給予明確回答。例如，有學(xué)者撰文分析GIK臨床試驗(yàn)陰性結(jié)果的可能原因是GIK使

2、用過(guò)程中血糖控制不當(dāng)，但這一觀點(diǎn)尚未得到實(shí)驗(yàn)確證，胰島素降糖作用（即血糖依賴性作用）在胰島素心肌保護(hù)效應(yīng)中充當(dāng)著怎樣的角色，有待進(jìn)一步探討，且對(duì)于這一問(wèn)題的研究在GIK/胰島素的臨床應(yīng)用具有重要價(jià)值。
　　我們?cè)谇捌诘难芯抗ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，胰島素除代謝調(diào)節(jié)作用外，可以直接激活心血管內(nèi)源性Akt-eNOS系統(tǒng)，激活細(xì)胞“生存信號(hào)”保護(hù)缺血心臟。我們和國(guó)際上多個(gè)實(shí)驗(yàn)室也相繼報(bào)道了胰島素糖代謝作用以外的直接心血管保護(hù)效應(yīng)，如抑制心肌細(xì)胞凋亡、

3、保護(hù)血管內(nèi)皮、抗炎、抗氧化應(yīng)激、正性肌力作用等。然而，以往對(duì)于上述胰島素非代謝性效應(yīng)的觀察往往同時(shí)與胰島素降糖過(guò)程相伴隨，胰島素降糖以外的心肌保護(hù)作用與其代謝調(diào)節(jié)作用的相互關(guān)系及各自的作用尚不明確。
　　針對(duì)這一問(wèn)題，最近危重癥治療研究領(lǐng)域根據(jù)臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果率先提出，危重癥治療中胰島素帶來(lái)的治療收益完全取決于并得益于其降糖作用，而胰島素降糖以外的作用甚微。然而遺憾的是，上述對(duì)于胰島素應(yīng)用于危重癥的臨床和實(shí)驗(yàn)觀察并未評(píng)價(jià)心臟損傷

4、和心血管終點(diǎn)事件。因此，胰島素在AMI中的心肌保護(hù)作用是否應(yīng)完全歸功于其降糖作用，抑或存在血糖非依賴性的直接保護(hù)效應(yīng)？闡明胰島素對(duì)缺血心肌的保護(hù)效應(yīng)與血糖的關(guān)系，并尋找血糖非依賴性心肌保護(hù)效應(yīng)存在的直接證據(jù)和作用機(jī)制，將對(duì)胰島素在AMI的臨床應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)價(jià)值。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　利用接近于臨床的大動(dòng)物模型，探討心肌缺血再灌注過(guò)程中，胰島素血糖依賴性和非依賴性作用的相互關(guān)系及各自對(duì)胰島素心肌保護(hù)效應(yīng)的意義和相

5、關(guān)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1.將犬隨機(jī)分為4組：正常胰島素、正常血糖組(NormalInsulin/Euglycemia,NI/NG組);正常胰島素、高血糖組(NormalInsulin/Hyperglycemia,NI/HG組);高胰島素、正常血糖組(HighInsulin/Euglycemia,HI/NG組）;高胰島素、高血糖組(HighInsulin/Hyperglycemia,HI/HG組)。為阻斷因血糖波動(dòng)引起的

6、內(nèi)源性胰島素釋放，通過(guò)結(jié)扎犬胰周血管阻斷胰島素分泌入血。建立犬急性心肌缺血再灌注（MI/R）模型：利用電磁流量計(jì)和血管狹窄器制造50分鐘的局部定量缺血，使左前降支（LAD）血流量降低80％，此后釋放狹窄器恢復(fù)血流，再灌注4小時(shí)。于再灌注前5分鐘微量泵靜脈輸注50％葡萄糖和GIK極化液用于對(duì)血糖和血漿胰島素水平的干預(yù)。
　　2.實(shí)時(shí)測(cè)量血糖，血漿胰島素、C肽水平、游離脂肪酸含量，以進(jìn)行血糖和胰島素水平控制和代謝評(píng)價(jià)。于缺血前、缺血后

7、50min及再灌注4h分別同時(shí)從前室間隔靜脈和左股動(dòng)脈取血，立即進(jìn)行血?dú)夥治?，檢測(cè)PO2、PCO2、pH、血紅蛋白(Hb)及血樣飽和度(SO2)，用于計(jì)算LAD灌注區(qū)心肌組織氧耗率和心肌呼吸指數(shù)。
　　3.通過(guò)多道生理記錄和分析處理系統(tǒng)持續(xù)記錄犬心電、冠脈LAD血流量和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。于再灌注結(jié)束后用伊文氏藍(lán)/TTC雙染色法測(cè)定心肌梗死面積。血漿肌鈣蛋白T作為心肌損傷標(biāo)志物，用于細(xì)胞壞死程度的評(píng)價(jià)。采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)Ca

8、spase-3活化及TUNEL凋亡指數(shù)用于定性和定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　4.采用石蠟包埋切片的蘇木素-伊紅染色方法，評(píng)價(jià)再灌注后心肌壞死周邊區(qū)白細(xì)胞浸潤(rùn)程度，同時(shí)測(cè)量組織中髓過(guò)氧化物酶（MPO）含量以定量評(píng)估組織炎癥反應(yīng)水平。檢測(cè)組織丙二醛(MDA)含量用于評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化水平，測(cè)量超氧化物歧化酶(SOD)以評(píng)價(jià)內(nèi)源性抗氧化能力。
　　5.在數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)過(guò)程中采用嚴(yán)格排除標(biāo)準(zhǔn)以保證各實(shí)驗(yàn)組納入的動(dòng)物樣本具有可比性。
　

9、　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功建立犬急性心肌缺血再灌注損傷模型。再灌注后心肌出現(xiàn)明顯梗死區(qū)，細(xì)胞凋亡和壞死，及組織炎癥反應(yīng)和氧化損傷。
　　2.胰腺手術(shù)造成的胰腺缺血和局限性炎癥在實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)程內(nèi)對(duì)全身性炎癥反應(yīng)和心臟功能影響甚微。通過(guò)平行實(shí)驗(yàn)，在建立心肌缺血再灌注模型前分別實(shí)施胰周血管結(jié)扎手術(shù)和假手術(shù)以對(duì)比觀察。兩組間血清胰淀粉酶、胰脂肪酶、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的基礎(chǔ)值和術(shù)后5小時(shí)測(cè)量值

10、均無(wú)顯著性差異，且血流動(dòng)力學(xué)的同步觀測(cè)顯示心臟功能亦無(wú)明顯變化。
　　3.高血糖存在情況下心肌I/R損傷程度進(jìn)一步加重。表現(xiàn)為高血糖組較正常血糖組心肌收縮功能恢復(fù)障礙進(jìn)一步加重，梗死面積擴(kuò)大，細(xì)胞凋亡和壞死增多，炎癥和氧化損傷加重（NI/HGvs.NI/NG,HI/HGvs.HI/NG,n=8,P<0.05）。
　　4.胰島素干預(yù)可顯著增加冠脈流量，提高代謝效率，增強(qiáng)心肌收縮功能，且這些有益作用不受血糖高低的影響。高胰島素組

11、較正常胰島素組再灌注后收縮功能（心率壓力指數(shù)、最大收縮速率）明顯提高，LAD灌流區(qū)血流量增加，心肌組織葡糖糖攝取率明顯升高，游離脂肪酸（FFA）攝取率輕微下降，心臟呼吸指數(shù)明顯上升（HI/NGvs.NI/NG,HI/HGvs.NI/HG,n=8,P<0.05），提示胰島素誘導(dǎo)心肌氧化代謝底物由FFA向葡萄糖轉(zhuǎn)變。且在心功能明顯改善的前提下，心肌氧耗并未顯著增高，表明心肌氧利用率的提高。
　　5.當(dāng)血糖鉗夾在生理水平時(shí)，胰島素水平升

12、高可進(jìn)一步縮小梗死面積，抑制細(xì)胞壞死和凋亡，降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激(HI/NGvs.NI/NG,n=8,P<0.05)。但此作用需以降糖為前提，高血糖存在時(shí)，上述保護(hù)作用消失(HI/HGvs.NI/HG,n=8,P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.高血糖可顯著加重心肌損傷并掩蓋胰島素保護(hù)作用，因而胰島素降糖作用在其抗I/R損傷保護(hù)缺血心肌的效應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色。
　　2.胰島素具有獨(dú)立于降糖效應(yīng)、直接的心血管保護(hù)作用

13、，其中包括不依賴于血糖控制水平的直接正性肌力作用、冠脈擴(kuò)張作用及對(duì)心肌氧化代謝效率的促進(jìn)作用。更為重要的是，胰島素減輕心肌損傷，抑制細(xì)胞凋亡，降低組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的有益作用，雖然依賴于正常血糖的維持，但獨(dú)立于降糖作用而存在。
　　PartII胰島素抗腎上腺素能心肌保護(hù)新機(jī)制的研究
　　研究背景:
　　急性心肌缺血發(fā)生時(shí)普遍存在著心臟交感-腎上腺素能系統(tǒng)的激活，一系列證據(jù)提示，交感-腎上腺素能活性增強(qiáng)及其介導(dǎo)的兒茶

14、酚胺分泌釋放是加重缺血心肌損傷、誘導(dǎo)致命性心律失常發(fā)生的重要原因之一，且與心臟重構(gòu)、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中，兒茶酚胺對(duì)心臟的直接作用主要由β-腎上腺素受體(adrenergicreceptor,AR)所介導(dǎo)，因此β受體阻滯劑被廣泛應(yīng)用于臨床AMI的治療。
　　越來(lái)越多的證據(jù)表明，胰島素除了在維持心肌代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用外，還在多種生理、病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。通過(guò)前述實(shí)驗(yàn)一的研究，我們?cè)诖髣?dòng)物MI/R模型上首次證實(shí)

15、了胰島素獨(dú)立于降糖作用之外直接的心肌保護(hù)作用。例如，我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，胰島素可激活“PI3K-Akt-eNOS”細(xì)胞生存信號(hào)抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)冠脈內(nèi)皮，抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促進(jìn)再灌注后心臟功能的恢復(fù)。此外，我們和國(guó)際上多個(gè)實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn)了胰島素的直接心臟正性變力作用，表現(xiàn)為在整體動(dòng)物模型中增強(qiáng)心肌收縮功能，在細(xì)胞水平增強(qiáng)收縮幅度和鈣瞬變。
　　心肌細(xì)胞膜上同時(shí)存在著大量的胰島素受體和β受體。已有研究報(bào)道，在人脂肪細(xì)胞和平

16、滑肌細(xì)胞中，胰島素可直接對(duì)抗兒茶酚胺的脂解作用；相關(guān)分子水平的研究也支持胰島素對(duì)β受體信號(hào)調(diào)控作用的存在。最近有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，心肌細(xì)胞中PI3K信號(hào)可抵消cAMP信號(hào)系統(tǒng)介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和正性變力作用。然而，在心肌細(xì)胞中，胰島素對(duì)β受體激動(dòng)效應(yīng)可能的調(diào)控作用所知甚少，目前僅有的少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道尚存爭(zhēng)議。
　　兒茶酚胺的正性肌力作用主要通過(guò)β受體內(nèi)傳，經(jīng)cAMP的生成激活蛋白激酶A(PKA)，進(jìn)而磷酸化一系列下游分子，參與對(duì)興奮-收縮

17、偶聯(lián)的調(diào)控。其中PKA的靶分子之一肌漿網(wǎng)受磷蛋白(PLB)的磷酸化水平可直接調(diào)控SERCA2a活性，而后者是與心肌細(xì)胞Ca2+釋放、攝取、貯存有關(guān)的肌漿網(wǎng)內(nèi)主要鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，也是推動(dòng)心肌收縮舒張過(guò)程的關(guān)鍵蛋白酶。此外，MI/R伴發(fā)的一系列細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的改變，如兒茶酚胺的大量釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，氧化應(yīng)激等，均可通過(guò)改變PLB磷酸化狀態(tài)及SERCA2活性，加重MI/R心肌收縮功能的損傷。然而，MI/R時(shí)βAR激活加重心肌損傷，以及胰島素

18、對(duì)βAR系統(tǒng)的拮抗作用是否與肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的功能調(diào)節(jié)有關(guān)，目前尚不明確。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　本研究旨在探討急性MI/R過(guò)程中，胰島素是否對(duì)βAR系統(tǒng)具有調(diào)控作用；在回答第一個(gè)問(wèn)題的基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步圍繞細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的調(diào)節(jié)，尋求胰島素調(diào)控βAR系統(tǒng)作用的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.采用Langendorff離體灌流系統(tǒng)制備大鼠離體心臟缺血再灌注模型。離體灌流心臟隨機(jī)分為以下5組：⑴shamM

19、I/R組；⑵MI/R組：30min局部缺血/2h再灌注；⑶MI/R+Ins組：再灌注前5min開(kāi)始給予10-7mol/L胰島素；⑷MI/R+ISO組：缺血前10min開(kāi)始給予10-9mol/L異丙腎上腺素（ISO）；⑸MI/R+Ins+ISO組：再灌注前5min給予10-7mol/L胰島素并于再灌注前10min給予10-9mol/LISO直至再灌注結(jié)束。
　　2.于左心室插入充水球囊，由多道生理記錄系統(tǒng)連續(xù)采集左室壓力指標(biāo)，實(shí)時(shí)測(cè)

20、量心臟收縮功能。于再灌注結(jié)束后用伊文氏藍(lán)/TTC雙染色法測(cè)定心肌梗死面積。于心肌缺血前15min、缺血30min末、再灌注1h、再灌注2h分別收集冠脈流出液，用分光光度法測(cè)定肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）活性。DNAladder方法和TUNEL原位法分別定性和定量測(cè)量心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.取再灌注后心肌組織，制備心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)膜蛋白以測(cè)定Ca2+-ATPase活性。WesternBlot檢測(cè)SERCA2a蛋白表達(dá)水平、P