硒和維生素B1對(duì)黃綠青霉素所致心肌自噬依賴性凋亡的干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、目的：克山病(KD)是一種以心肌損傷為主要病理改變的地方性疾病，主要病因假說包括低硒和真菌毒素感染等。黃綠青霉素(CIT)是病區(qū)中的主要真菌毒素，廣泛存在于發(fā)霉谷物中，具有心臟、肝臟毒性等多種毒性作用，可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。有研究表明心源性腳氣病也與CIT有關(guān)。硒(Se)是人體必需的微量元素，具有抗氧化、抗炎等多種生物功能，實(shí)踐表明合理補(bǔ)硒可以有效降低KD的發(fā)病率并改善預(yù)后，但具體機(jī)制不明。維生素B1(VBl)也稱硫胺素，是人體必需的一

2、種水溶性維生素，當(dāng)發(fā)生硫胺素缺乏(TD)時(shí)可引發(fā)心源性腳氣病，臨床實(shí)踐表明補(bǔ)充VB1可以有效緩解心肌損傷癥狀，但其機(jī)制尚不明確。自噬對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用，但過度自噬會(huì)造成多種損傷，目前自噬在Se和VB1心肌保護(hù)中的作用尚不明確。本研究擬探討Se和VB1對(duì)CIT所致心肌損傷的干預(yù)機(jī)制。
　　方法：體內(nèi)試驗(yàn)中，以5周齡ICR雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，腹腔注射含0mg/kgbw、0.1mg/kg bw、0.3mg/kg bw CI

3、T的生理鹽水（含0.2％DMSO）20ml/kg bw/day，Se和VB1干預(yù)組各提供含Se(9mg/L)和VBl(20g/L)的飲水，同時(shí)腹腔注射含O mg/kg bw、0.3mg/kg bw CIT的生理鹽水(含0.2％DMSO)20ml/kg bw/day，共6周。用電子顯微鏡觀察小鼠心肌細(xì)胞中的自噬小體;用免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)小鼠心肌中自噬生物標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)-Ⅱ蛋白、Seques

4、tosome1(P62)蛋白，組織蛋白酶B(Cathepsin B)蛋白，線粒體外膜通透性改變生物標(biāo)記物細(xì)胞色素c(Cyt c)蛋白及線粒體凋亡生物標(biāo)記物B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)蛋白及Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白的表達(dá)情況;用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察小鼠心肌病理改變情況;用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清中心肌損傷標(biāo)記物肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白(cTnT)含量。
　　體外實(shí)驗(yàn)中，以大鼠心肌

5、細(xì)胞H9c2為研究對(duì)象，8μM CIT作用于H9c2細(xì)胞12h、24h和36h。用電子顯微鏡觀察細(xì)胞中的自噬小體;用熒光顯微鏡觀察經(jīng)吖啶橙(AO)染色的細(xì)胞溶酶體膜通透性改變情況;用熒光顯微鏡觀察經(jīng)JC-1染色的細(xì)胞線粒體膜電位(△Ψm)改變情況;用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白，Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表達(dá)情況;分光光度法檢測(cè)細(xì)胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性;用TUNE

6、L染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;用ELISA檢測(cè)培基中CK-MB、cTnY心肌酶水平。預(yù)先用自噬抑制劑3-MA及Se和VB1處理后，再以上述同樣的方式用CIT處理細(xì)胞，分別檢測(cè)上述各種方法中測(cè)得的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的變化情況。
　　結(jié)果：在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，電子顯微鏡下可見暴露于不同濃度CIT(0.1mg/kg bw、0.3mg/kg bw)后，小鼠心肌細(xì)胞中自噬小體數(shù)量增多，Se和VB1保護(hù)組未見明顯自噬小體聚集;染毒后小鼠心肌中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高

7、，P62蛋白的變化趨勢(shì)與之相反，Se和VB1保護(hù)組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較0.3mg/kg bw CIT處理組降低，P62蛋白升高;染毒后小鼠心臟組織中Cathepsm B蛋白水平升高，Se和VB1保護(hù)組Cathepsin B蛋白水平較0.3mg/kg bw CIT處理組降低;染毒后小鼠心肌中Cyt c蛋白水平升高，Se和VB1保護(hù)組Cyt c蛋白水平較0.3mg/kg bw CIT處理組降低;染毒后小鼠心肌中Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2

8、蛋白的變化趨勢(shì)與之相反，Se和VB1保護(hù)組Bax蛋白表達(dá)較0.3mg/kg bw CIT處理組降低，Bcl-2蛋白升高;染毒后小鼠血清中CK-MB、cTnT心肌酶水平升高，Se和VB1保護(hù)組CK-MB、cTnT心肌酶水平較0.3mg/kg bw CIT處理組降低;染毒后小鼠心肌HE染色可見明顯病理改變，Se和VB1保護(hù)組病理改變不明顯。
　　體外實(shí)驗(yàn)中，電子顯微鏡下可見暴露于8μM CIT后，H9c2細(xì)胞中自噬小體增加，Se和VB

9、1保護(hù)組自噬小體數(shù)量與之相比明顯減少;8μM CIT處理12h，細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高，P62蛋白的變化趨勢(shì)與之相反，經(jīng)Se和VB1預(yù)處理后LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)較8μM CIT處理組降低，P62蛋白升高;熒光顯微鏡下觀察到8μM CIT處理細(xì)胞24h后，溶酶體膜穩(wěn)定性下降，通透性增加，而經(jīng)3-MA、Se和VB1預(yù)處理后溶酶體膜通透性增加情況與8μM CIT處理組相比有明顯緩解;熒光顯微鏡下觀察到8μM CIT處理細(xì)胞24h后，線粒體

10、膜電位下降，而經(jīng)3-MA、Se和VB1預(yù)處理后線粒體膜電位下降程度較8μMCIT處理組有明顯緩解;8μM CIT處理細(xì)胞24h后，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白的變化趨勢(shì)與之相反，經(jīng)3-MA、Se和VB1預(yù)處理后Bax蛋白表達(dá)較8μM CIT處理組降低，Bcl-2蛋白升高;分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性發(fā)現(xiàn)8μM CIT處理細(xì)胞36h后細(xì)胞中Caspase-3活性增加，經(jīng)3-MA、Se和VB1預(yù)處理后Caspase-3活

11、性與8μM CIT處理組相比明顯降低;TUNEL染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在8μM CIT處理36h后發(fā)生凋亡，用3-MA、Se和VB1預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡較8μM CIT處理組明顯緩解;8μM CIT處理36h，細(xì)胞培養(yǎng)液中CK-MB、cTnT心肌酶水平升高，經(jīng)Se和VB1預(yù)處理后CK-MB、cTnT心肌酶水平較8μM CIT處理組明顯降低。
　　結(jié)論：CIT可以引起過度自噬，同時(shí)通過溶酶體-線粒體軸誘發(fā)凋亡;Se和VB1均可通過抑制自噬來