PPARγ--mTORC2通路介導(dǎo)黃綠青霉素所致細(xì)胞自噬的作用研究.pdf

1、目的：黃綠青霉素(citreoviridin，CIT)是一種由黃綠青霉菌、赭鮭色正青霉菌及土霉菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有心臟和肝臟毒性。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)CIT可激活肝臟細(xì)胞的自噬過程，而CIT引起自噬的上游通路并未明確。近期研究表明，過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用，可通過調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mTORC2)調(diào)控自噬過程。但是在不同的組織細(xì)胞中，PPARγ的分布和發(fā)揮的作用各

2、不相同。本研究擬探討CIT引起自噬的上游通路及PPARγ在CIT誘導(dǎo)的心臟和肝臟自噬中發(fā)揮的作用。
　　方法：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，以ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過腹腔注射使小鼠暴露于濃度為0.1mg/kg體重(bw)和0.3mg/kg bw的CIT，共6周。用蘇木精-伊紅染色法（HE染色法）觀察小鼠心臟和肝臟的組織形態(tài)變化;用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA法）檢測(cè)小鼠血清中心肌肌鈣蛋白T(cTnT)和肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)的水平;用

3、反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)小鼠心臟和肝臟組織中PPARγ靶基因的表達(dá)情況;用免疫蛋白印跡法(Westem blot)檢測(cè)小鼠心臟和肝臟組織中磷酸化蛋白激酶B(phospho-protein kinase B，p-PKB，又稱p-AKT)(Ser473)蛋白、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1light chain3，LC3)蛋白及sequestosome1(P62)蛋白的

4、表達(dá)情況。
　　體外實(shí)驗(yàn)中，以大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)和人肝癌細(xì)胞（HepG2）為研究對(duì)象，其中CIT處理H9C2細(xì)胞的濃度為2μM～8μM，處理HepG2細(xì)胞的濃度為1.25μM～5μM，作用時(shí)間均為24h，用PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(RSG)處理細(xì)胞，研究PPARγ發(fā)揮的作用。用RT-qPCR檢測(cè)H9C2和HepG2細(xì)胞中PPARγ靶基因的表達(dá)情況;用PPARγ轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)H9C2和HepG2細(xì)胞中PPARγ-錄活性

5、;用Western blot檢測(cè)H9C2和HepG2細(xì)胞中p-AKT(Ser473)、LC3-Ⅱ及P62蛋白的表達(dá)情況;用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測(cè)H9C2和HepG2細(xì)胞活性;用ELISA法檢測(cè)H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中cTnT和CK-MB的水平。
　　結(jié)果：在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CIT處理的小鼠體重，心臟指數(shù)及肝臟指數(shù)與對(duì)照組小鼠相比均無明顯差異;HE染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CIT處理的小鼠心臟組織與對(duì)照

6、組相比心肌纖維輪廓不明顯、排列紊亂。CIT處理的小鼠肝臟組織與對(duì)照組相比出現(xiàn)脂質(zhì)空泡，顯示脂質(zhì)聚集;ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CIT處理的小鼠血清中心肌酶cTnT和CK-MB的水平均隨著CIT濃度的升高而升高;RT-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CIT處理的小鼠心臟和肝臟組織PPARγ靶基因的表達(dá)隨著染毒劑量增加而減少;Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟和肝臟組織p-AKT(Ser473)和P62蛋白表達(dá)量隨著CIT濃度升高而減少，LC3-Ⅱ蛋白變

7、化趨勢(shì)與其相反。
　　體外實(shí)驗(yàn)中，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H9C2和HepG2細(xì)胞中PPARγ靶基因的表達(dá)隨著CIT濃度升高而減少;Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H9C2和HepG2細(xì)胞中p-AKT(Ser473)蛋白表達(dá)隨著CIT濃度的升高而減少，而在RSG預(yù)處理組，其表達(dá)量較CIT處理組蛋白表達(dá)量明顯上升;H9C2和HepG2細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量隨著CIT濃度升高而增多，P62蛋白變化趨勢(shì)與其相反。而在RSG預(yù)處理組

8、，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量較CIT處理組表達(dá)量明顯下降，P62蛋白表達(dá)量較CIT處理組表達(dá)量明顯上升;MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H9C2和HepG2細(xì)胞活性隨著CIT濃度增加而逐漸降低，在RSG和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)預(yù)處理組，H9C2和HepG2細(xì)胞活性相較于染毒組升高;ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中cTnT和CK-MB的水平均隨著CIT濃度的升高而升高，在RSG和3-MA預(yù)處理組，H9C2細(xì)