青霉素酶基因異源表達(dá)及青霉素酶固定化研究.pdf

1、青霉素酶是B-內(nèi)酰胺酶的一種,由于其具有水解青霉素類抗生素的B-內(nèi)酰胺環(huán)的特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。但是國內(nèi)該酶的產(chǎn)酶菌株Bacillus cereus CMOC(B)63301存在著產(chǎn)酶能力較低、培養(yǎng)基價(jià)格昂貴和生產(chǎn)過程中酶活力不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。本論文以遺傳背景較清楚的Bacillus cereusATCC10987為出發(fā)菌株,通過分子生物學(xué)手段重點(diǎn)研究了青霉素酶基因(penp)的克隆及分別在大腸桿菌與枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá),并對(duì)重組菌的發(fā)酵

2、條件進(jìn)行了優(yōu)化,同時(shí)對(duì)經(jīng)過純化的青霉素酶的固定化進(jìn)行研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.青霉素酶基因的克隆及在大腸桿菌中表達(dá)以Bacillus cereus 10987總DNA為模板,通過PCR技術(shù)獲得了青霉素酶成熟肽基因,構(gòu)建克隆載體pUC-penp:構(gòu)建表達(dá)載體pET28-penp,將其電轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)后酶活力為227.8U/mL:通過單因素試驗(yàn)對(duì)重組菌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,酶活力可達(dá)

3、到480U/mL。
　　 2.青霉素酶的固定化及分解牛乳中殘留青霉素的研究利用Ni2+親合層析柱純化了重組菌表達(dá)的目的蛋白,純化后的目的蛋白純度超過90％。確定了高碘酸鈉氧化法制備載體的條件和固定化青霉素酶的條件,并利用該固定化酶將牛奶(含0.5U青霉素G/ml)中的青霉素分解到濃度小于4μg/L。另外,還對(duì)該固定化酶的操作穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。
　　 3.青霉素酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)將青霉素酶基因克隆