重組青霉素酶TEM-1的克隆表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、青霉素酶TEM-1是β-內(nèi)酰胺酶的一種，由于其具有水解青霉素類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)的特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。國內(nèi)該類酶的產(chǎn)酶菌株存在著產(chǎn)酶能力較低、培養(yǎng)基價(jià)格昂貴和生產(chǎn)過程中酶活性不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。本論文利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建青霉素酶大腸桿菌表達(dá)菌株，通過20L生產(chǎn)青霉素酶，經(jīng)過純化得到高活性高純度的酶蛋白，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。
　　目的:建立高效表達(dá)及純化青霉素酶TEM-1的方法;并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和功效進(jìn)行研究。
　　方法:將

2、構(gòu)建質(zhì)粒pET22b-penp轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到大腸桿菌BL21中，經(jīng)鑒定篩選后，用IPTG誘導(dǎo)，使青霉素酶TEM-1大量表達(dá)。對(duì)菌體破菌后收集、復(fù)性包涵體，并用DEAE-Sepharose層析柱純化蛋白;在羥胺法的基礎(chǔ)上，測(cè)定了青霉素酶TEM-1的最適反應(yīng)pH值、最適反應(yīng)溫度、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性及加輔料穩(wěn)定性。同時(shí)使用微生物法測(cè)定了青霉素酶TEM-1的功效作用譜。
　　結(jié)果:通過表達(dá)優(yōu)化，每20L發(fā)酵液能得到800g菌體，經(jīng)電泳檢測(cè)

3、表達(dá)量在25％以上，純化后每升發(fā)酵液可得到酶蛋白800mg以上;純化后的青霉素酶TEM-1的純度大于95％，比活性大于3000萬U/mg;青霉素酶TEM-1的最適反應(yīng)pH值是pH7.0，最適反應(yīng)溫度是37℃;其在10％丙氨酸或10％甘油體系中，pH7.0、4℃條件下較穩(wěn)定;青霉素酶TEM-1主要對(duì)青霉素類及頭孢一代抗生素有良好的分解作用。
　　結(jié)論:1、構(gòu)建了能高效表達(dá)青霉素酶TEM-1的工程菌;
　　2、建立了青霉素酶TE