嚴(yán)重?zé)齻笕毖鹾挺履I上腺素能受體持續(xù)激活導(dǎo)致心肌損害的機(jī)制及心肌保護(hù).pdf

1、嚴(yán)重?zé)齻笮墓δ懿蝗霈F(xiàn)較早,可誘發(fā)或加重休克,成為燒傷后多器官功能不全(MODS)的重要啟動(dòng)因素之一[1]。在各種動(dòng)物模型和人心臟中的大量研究表明不斷增加的心肌細(xì)胞凋亡是心功能不全的主要原因。燒傷后心肌局部血流量迅速減少,發(fā)生缺氧損害,缺氧損害本身即可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡。與此同時(shí)嚴(yán)重?zé)齻鸬某掷m(xù)應(yīng)激狀態(tài)使交感-腎上腺素髓質(zhì)興奮性增加,血液兒茶酚胺上升為正常的7～8倍[2],進(jìn)而持續(xù)激活心肌細(xì)胞上的β腎上腺素能受體(β-AR),最終導(dǎo)

2、致心肌細(xì)胞凋亡或者壞死。因此缺氧和β。腎上腺素能受體過(guò)度激活可能是嚴(yán)重?zé)齻笮募〖?xì)胞死亡的兩大損傷因素。
　　 熱休克蛋白90(HSP90)作為一種分子伴侶,其作用是維護(hù)大量蛋白折疊和構(gòu)象成熟。HSP90除了具有分子伴侶功能,還參與調(diào)節(jié)了多種細(xì)胞信號(hào)通路和細(xì)胞功能[3]。研究證明HSP90對(duì)多種凋亡誘導(dǎo)因子引起的心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)了HSP90是否具有抗缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用。
　　 我們建立體

3、外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞缺氧模型,應(yīng)用HSP90的特異性抑制劑格爾德霉素(geldanamycin,GA)抑制心肌細(xì)胞HSP90活性。我們運(yùn)用MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力,酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的漏出率、TUNEL,染色檢測(cè)心肌凋亡率等觀測(cè)多項(xiàng)細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)。結(jié)果顯示:缺氧引起心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞活力下降,并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;用GA抑制HSP90活性后,心肌細(xì)胞活力下降和細(xì)胞凋亡明顯加劇。這

4、些結(jié)果明確了HSP90對(duì)心肌具有抗缺氧損傷的內(nèi)源性保護(hù)效應(yīng)。
　　 我們進(jìn)一步探討了HSP90抗缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(P13K/Akt)信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,通過(guò)影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài),在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用。P13K/Akt信號(hào)通路能夠提高心肌功能和促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活。研究提示HSP90可能是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)的

5、上游調(diào)節(jié)分子。所以我們假設(shè)HSP90對(duì)嚴(yán)重?zé)齻蟮男募〖?xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)控P13K/Akt通路的抗凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)這一假設(shè)進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　 我們應(yīng)用Western Blot檢測(cè)心肌細(xì)胞缺氧損傷后HSP90蛋白表達(dá)規(guī)律,并運(yùn)用GA抑制HSP90后檢測(cè)缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞P13K/Akt通路中的多種效應(yīng)分子如Akt,Bcl-2家族促凋亡基因Bad,GSK-3β,細(xì)胞色素C等的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示:心肌細(xì)胞中HSP90蛋白

6、和磷酸化Akt在缺氧后表達(dá)明顯增高,Akt下游效應(yīng)分子Bad和GSK-3β的磷酸化水平升高,說(shuō)明P13K/Akt信號(hào)通路在心肌細(xì)胞缺氧早期也被激活。用GA抑制HSP90活性后Akt和Bad的磷酸化被阻斷,從線粒體釋放至細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C明顯增加,說(shuō)明HSP90的心肌保護(hù)作用與P13K/Akt信號(hào)通路相關(guān),即HSP90保持Akt的磷酸化穩(wěn)定性并促進(jìn)Akt下游底物Bad的磷酸化,抑制細(xì)胞色素C從心肌細(xì)胞線粒體的釋放,從而起到抗凋亡的作用。<

7、br>　　 另一方面,我們檢測(cè)HSP90是否具有抗β腎上腺素能受體過(guò)度激活誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡的作用。我們利用異丙腎上腺素(Isoproterenol,ISO)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成年小鼠心肌細(xì)胞死亡,模擬嚴(yán)重?zé)齻螃履I上腺素能受體持續(xù)激活誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡。結(jié)果顯示ISO對(duì)心肌細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用(導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死);用GA抑制HSP90后,ISO對(duì)心肌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用不受影響,提示HSP90對(duì)GA對(duì)β腎上腺素能受體過(guò)度激活導(dǎo)致的心肌損傷

8、無(wú)保護(hù)作用。
　　 我們進(jìn)一步探討了β腎上腺素能受體過(guò)度激活導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的作用機(jī)制,并尋求針對(duì)該損傷因素的心肌保護(hù)方法。研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重?zé)齻l(fā)生后心肌細(xì)胞中出現(xiàn)大量的游離鈣累積(鈣超載),而且燒傷后通過(guò)細(xì)胞膜L型鈣通道(LTCC)進(jìn)入胞內(nèi)的鈣內(nèi)流明顯增加。因?yàn)長(zhǎng)TCC是β腎上腺素能受體信號(hào)系統(tǒng)的重要底物蛋白,本實(shí)驗(yàn)假設(shè):β腎上腺素能受體過(guò)度激活是通過(guò)增加經(jīng)LTCC的鈣內(nèi)流導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死。因?yàn)長(zhǎng)TCC和β腎上腺素能受體相互作用密

9、切,以往的研究沒(méi)有將二者有效分離開(kāi)來(lái)研究其分別機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)利用LTCC亞基p2a轉(zhuǎn)基因小鼠模型首次檢測(cè)了β腎上腺素能受體和LTCC在心肌細(xì)胞死亡中各自獨(dú)立的作用機(jī)制。
　　 我們?cè)蛛x成年野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的心室肌細(xì)胞后進(jìn)行體外培養(yǎng),然后檢測(cè)各種藥物干預(yù)情況下(包括β腎上腺素能受體非選擇性激動(dòng)劑ISO、其他β腎上腺素能受體調(diào)節(jié)藥物、鈣調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控藥物、caspase和活性氧簇抑制劑等)心肌細(xì)胞的生存率。同時(shí)我們還觀察了β腎上

10、腺素能受體各亞型的不同作用機(jī)制。
　　 我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)基因心肌細(xì)胞在培養(yǎng)中的細(xì)胞死亡率明顯高于野生型心肌細(xì)胞。野生型和轉(zhuǎn)基因心肌細(xì)胞的死亡率都被ISO加重,但是ISO不增加轉(zhuǎn)基因心肌細(xì)胞的LTCC大小,LTCC抑制劑Nifedipine只能部分抑制心肌細(xì)胞死亡。這些結(jié)果表明ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡具有LTCC依賴和非依賴的兩種機(jī)制。ISO通過(guò)增強(qiáng)肌漿網(wǎng)Ca2+ ATP酶(鈣泵,SERCA),鈉/鈣交換蛋白(NCX)和鈣/鈣調(diào)

11、蛋白依賴性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的功能增加野生型和轉(zhuǎn)基因心肌細(xì)胞的收縮功能。Caspase和ROS抑制劑不能減少LTCC或ISO導(dǎo)致的心肌細(xì)胞死亡。激活β腎上腺素能受體具有一定的心肌保護(hù)作用。這些結(jié)果提示β腎上腺素能受體持續(xù)激活導(dǎo)致的心肌細(xì)胞壞死主要是通過(guò)β1腎上腺素能受體介導(dǎo)的LTCC增加的機(jī)制,但其他的機(jī)制參與不能排除。
　　 總之,我們的研究提示HSP90具有抗缺氧誘導(dǎo)的凋亡的心肌保護(hù)作用。我們的研究還提示:通過(guò)減少通過(guò)LT