自噬在嚴(yán)重?zé)齻缙谛募p害中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 嚴(yán)重?zé)齻缙?，在毛?xì)血管通透性增加造成血容量顯著下降之前，就已出現(xiàn)了明顯的心肌損害。這種即早出現(xiàn)的心肌損害，不僅誘發(fā)或加重休克，而且是其它臟器如肝、腎、腸等缺血缺氧性損害的重要因素之一。但嚴(yán)重?zé)齻缙谛募p害的機(jī)制尚不完全清楚。自噬是真核細(xì)胞高度保守的自我保護(hù)機(jī)制，它通過對細(xì)胞內(nèi)長壽命蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等進(jìn)行消化降解，以實(shí)現(xiàn)氨基酸、脂肪酸等原料的循環(huán)利用。自噬也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，自噬性細(xì)胞死亡被稱第二型程序性細(xì)胞死亡，是

2、區(qū)別于壞死和凋亡的第三種細(xì)胞死亡方式。本研究旨在觀察自噬在嚴(yán)重?zé)齻笮募p害中的作用，并探討在缺氧和/或AngⅡ刺激條件下自噬發(fā)生的調(diào)控機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1.以30％Ⅲ度燙傷S-D大鼠為燒傷模型，以頸總動(dòng)脈插管的方式檢測燒傷后1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和12小時(shí)活體心功能；同樣時(shí)相點(diǎn)剖取大鼠心臟，以Langendorff裝置行游離心臟體外灌流，檢測體外心功能的變化。
　　 2.各時(shí)相點(diǎn)留取心肌標(biāo)本，提

3、取總蛋白，行免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blotting)觀察自噬標(biāo)志性蛋白質(zhì)LC3和Beclin1表達(dá)，以反映燒傷后心肌細(xì)胞自噬活性的變化。
　　 3.對各時(shí)相點(diǎn)心肌組織標(biāo)本行免疫熒光染色，觀察燒傷后心肌細(xì)胞自噬性死亡(Ubiquitin標(biāo)記)、凋亡(TIFNEL標(biāo)記)和壞死(C5b9標(biāo)記)的變化。
　　 4.以加入自噬激活劑或抑制劑的K-H液對燒傷大鼠游離心臟進(jìn)行灌流，觀察心功能的變化、心肌細(xì)胞自噬活性和自噬性細(xì)胞

4、死亡的變化；同樣以.ACEI、AT1受體阻滯劑和ROS抑制劑來灌流游離心臟，觀察其對自噬和心功能的影響。
　　 5.原代培養(yǎng)S-D大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，以缺氧和/或AngⅡ刺激來模擬燒傷后心肌細(xì)胞的應(yīng)激條件，首先以透射電鏡確認(rèn)此條件下心肌細(xì)胞自噬活性的變化。
　　 6.再以DHE活細(xì)胞熒光染色來半定量缺氧和/或AngⅡ刺激條件下心肌細(xì)胞ROS含量；以MDC活細(xì)胞熒光染色以及Western Blotting方法來確定心肌細(xì)胞自

5、噬活性的改變。抑制ROS后觀察以上指標(biāo)變化，明確ROS與自噬間的關(guān)系。
　　 7.以ELISA的方法來定量缺氧和/或AngⅡ刺激條件下心肌細(xì)胞內(nèi)PKCδ和PKCε表達(dá)量的變化，同時(shí)確認(rèn)重組慢病毒siRNA調(diào)低PKCε表達(dá)的效果。
　　 8.通過PKCδ特異性的抑制劑及PKCε慢病毒siRNA干擾，觀察病缺氧和/或AngⅡ刺激條件下心肌細(xì)胞ROS含量和自噬活性的變化，明確PKCδ和PKCε在這些應(yīng)激條件下的作用。
　

6、　 結(jié)果：
　　 1.嚴(yán)重?zé)齻笤缙谛募〖?xì)胞自噬活性即顯著增強(qiáng)，傷后3小時(shí)，即可發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞自噬性死亡的組織學(xué)變化，早于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，并且其發(fā)生率高于凋亡，表明自噬性細(xì)胞死亡是燒傷后心肌細(xì)胞死亡的重要途徑。
　　 2.在游離心臟體外灌流模型上對自噬施加正負(fù)調(diào)控的結(jié)果表明，在燒傷后的特定時(shí)間段(傷后3小時(shí)以后)，心肌細(xì)胞自噬可能發(fā)揮有害作用，抑制自噬能減少心肌細(xì)胞自噬性死亡數(shù)量，增強(qiáng)心功能。
　　 3.30

7、％Ⅲ度燒傷后6小時(shí)大鼠游離心臟灌流實(shí)驗(yàn)提示，在燒傷這種應(yīng)激條件下，AngⅡ和ROS可能是誘發(fā)和激活心肌細(xì)胞自噬的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
　　 4.體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞，在缺氧和/或AngⅡ刺激條件下自噬活性增強(qiáng)，同時(shí)伴有細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高。
　　 5.無論是在缺氧和/或AugⅡ刺激條件下，抑制ROS都能明顯抑制原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞自噬活性，提示ROS可能是誘導(dǎo)自噬的直接原因。
　　 6.以特異性的抑制劑Rottler

8、in抑制PKCδ活性，在缺氧或混合AugⅡ刺激條件下細(xì)胞ROS含量和自噬活性明顯降低，而在單獨(dú)AugⅡ刺激條件下對ROS和自噬無影響。該結(jié)果提示，心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)自噬可能是經(jīng)由PKCδ而發(fā)揮作用，但PKCδ不參與調(diào)控AngⅡ誘導(dǎo)自噬的過程。
　　 7.通過慢病毒載體對心肌細(xì)胞PKCε進(jìn)行siRNA干擾，致使其PKCε蛋白表達(dá)水平降低，發(fā)現(xiàn)調(diào)低PKCε在AngⅡ刺激或合并缺氧的條件下能使心肌細(xì)胞ROS含量下降并調(diào)低自噬活性，而在單

9、純?nèi)毖鯒l件下對ROS和自噬活性無影響。這提示PKCε是AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬的重要介導(dǎo)分子。
　　 結(jié)論：
　　 嚴(yán)重?zé)齻螅毖鹾虯ngⅡ刺激都能使心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，ROS通過氧化損傷胞內(nèi)大分子蛋白質(zhì)以及破壞線粒體而誘發(fā)細(xì)胞自噬增強(qiáng)。然而，兩者是通過不同信號(hào)通路來發(fā)揮作用的：單純?nèi)毖跽T導(dǎo)自噬可能依賴PKCδ/NADPH oxidase/ROS途徑，而AngⅡ則首先與AT1受體結(jié)合，然后激活下游的PKCε/NA