H11蛋白基因在燒傷早期心肌損害中的作用及其機制.pdf

1、研究背景與總體思路 器官損害及多臟器功能障礙(MOF)是燒傷病人在嚴(yán)重?zé)齻缙诒厝灰?jīng)歷的一次沖擊。重度燒傷后早期的急性缺血缺氧、大量炎癥因子釋放、休克和感染等可引起心肌損害和心功能下降，為此有人提出了燒傷后“休克心”的概念。多項研究表明，在燒傷早期，缺氧、缺血再灌注可以迅速加強各器官組織中表達一種稱為熱休克蛋白(HSP)的多肽類物質(zhì)，并發(fā)揮著一定的保護作用。HSP是一種高度保守的多肽類物質(zhì)，它能有效地保護機體在應(yīng)激條件下免受

2、外界因素的損害。已確定HSP60、HSP70等在燒傷所致的心肌損害中發(fā)揮著重要的保護作用。分子量為12-43kDa的HSP被稱為小熱休克蛋白(sHSP)，包括十余種HSP成員。H11蛋白基因是一種新發(fā)現(xiàn)的分子量為22kDa的sHSP亞家族成員，又稱為HSPB8、HSP22、H11激酶。初步的研究發(fā)現(xiàn)H11蛋白基因在腫瘤細胞凋亡、心肌細胞肥大和凋亡中可能發(fā)揮著一定的作用、同時它還具有促細胞生長和轉(zhuǎn)化，及分子伴侶作用。 為驗證這一想

3、法，并探討其中可能的機制，我們設(shè)計了以下研究方案： 首先，建立急性燒傷大鼠模型，通過觀察大鼠心電圖(ECG)、血液生化指標(biāo)(心肌酶)、心肌組織病理以及H11蛋白基因mRNA水平變化等，從整體動物水平，研究燒傷后心肌的損傷情況，并初步探討燒傷所致心肌損害對H11蛋白基因表達的影響及其變化規(guī)律。為進一步的實驗研究提供依據(jù)。 然后，根據(jù)動物大體實驗部分的研究結(jié)果，以原代心肌細胞為研究對象，分別在細胞水平模擬燒傷早期對產(chǎn)生損害作

4、用的不同刺激條件：缺氧、缺氧+內(nèi)毒素主要成分脂多糖(LPS)、熱應(yīng)激和去甲基化劑5-氮胞苷(5-Aza)刺激條件下進行培養(yǎng)，觀察不同刺激對心肌細胞的影響，檢測各組心肌細胞H11蛋白基因表達水平及其變化規(guī)律。初步探討H11蛋白基因?qū)齻缙谛募〉谋Ｗo作用及其機制。為進一步的機制研究提供依據(jù)。 最后，通過H11蛋白基因反義寡核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染缺氧心肌細胞，觀察其對心肌細胞生存率及凋亡的影響，并檢測心肌細胞H11蛋白基因表達水平

5、及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)及p38分裂活化蛋白激酶(MAPK)活化水平、炎性因子核因子κB(NF-κB)與腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，旨在探討H11蛋白基因在缺氧心肌細胞中的作用及其機制，從而揭示H11蛋白基因在燒傷早期所致心肌損傷中的作用及其機制。 第一部分：急性燒傷大鼠心肌損傷及H11蛋白基因的變化 目的： 建立大鼠重度燒傷模型，通過檢測燒傷后18h內(nèi)不同時段大鼠生化、病理和超微結(jié)構(gòu)改變等公

6、認指標(biāo)，明確重度燒傷心肌損傷的變化規(guī)律，并采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等分子生物學(xué)方法檢測H11蛋白基因的變化，從整體動物水平，研究燒傷后心肌的損傷，以及H11蛋白基因表達水平的變化規(guī)律。 方法： 實驗分為2組：對照組(n=6)和燒傷組(n=30)，后者依據(jù)燒傷后的后的時間不同分為5組，分別為1.5 h、3h、6 h、12 h、18h組(n=6)。采用自制的大鼠專用燙傷儀建立大鼠Ⅲ°30％總體表面積(TBSA)

7、燒傷模型，被燒傷的每組大鼠分別在燒傷后1.5 h、3h、6 h、12 h、18h描記Ⅱ?qū)?lián)ECG，記錄30s內(nèi)心律失常發(fā)生及ST段改變情況并處死動物，測定血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平，取心臟左室乳頭肌進行電鏡超微結(jié)構(gòu)檢測，心室肌常規(guī)病理切片，RT-PCR檢測H11蛋白基因mRNA表達。 結(jié)果： 心肌損害：與對照組比較，燒傷組大鼠ECG除燒傷后1．5h～3h出現(xiàn)心率增快、房性和室性早搏外，其余各時間點未見明顯心律

8、失常發(fā)生；燒傷后ECG改變主要表現(xiàn)為ST段逐漸抬高，且隨著致傷時間的延長而更為明顯，形成6h～12h的高峰；血清CK-MB水平在燒傷后3h明顯升高(P<0．05)，12h達到高峰(P<0．01)，并持續(xù)至18h仍然升高。 討論與結(jié)論： 嚴(yán)重?zé)齻蠹却嬖谌鏗SP70等保護性物質(zhì)的表達升高，也存在致傷因子如TNF-a、白介素-1β(IL-1β)等表達上調(diào)的情況，兩者之間存在相互影響。本研究進一步證實，在重度燒傷大鼠早期，心肌

9、存在明顯的損傷，這種損傷作用以燒傷后12h左右最為明顯，表現(xiàn)為ECG出現(xiàn)ST段抬高，心肌特異性標(biāo)記物CK-MB明顯升高，病理分析也證實心肌先后出現(xiàn)波紋狀改變，細胞間隙水腫，肌絲排列紊亂、斷裂，肌溶解等病理改變。 1、缺氧對心肌細胞損傷、H11蛋白基因表達影響及變化規(guī)律方法： 以SD大鼠乳鼠原代培養(yǎng)的心肌細胞，在培養(yǎng)的第5d根據(jù)干預(yù)條件不同分為6個組：對照組，缺氧1.5h組、3h組、6h組、12h組、18h組：對各組心肌細

10、胞施行相應(yīng)時間缺氧刺激(置于含5％C0<，2>及95％N<，2>的缺氧環(huán)境中)，分別于干預(yù)后1.5、3、6、12、18h收集標(biāo)本。 結(jié)果： 心肌細胞損傷：缺氧損傷1.5h后心肌細胞的搏動率明顯增加，搏動幅度增強，節(jié)律不規(guī)整。在損傷3h后細胞搏動率逐漸變慢，搏動幅度減弱，節(jié)律紊亂，至6h后與對照組有顯著的差別(P

11、肌細胞生存率：對照組心肌細胞存活率為91.5±8.2％，缺氧培養(yǎng)后心 肌細胞存活率隨時間推移明顯降低，分別為81.8±7.6％，72.2±8.0％.63.6±7.7％，54.1±6.9％和45.3±5.3％，與正常對照組均有顯著性差異。 Hll蛋白基因mRNA水平：RT-PCR結(jié)果顯示，正常組心肌細胞Hll蛋白基因mRNA表達水平極低，但缺氧組心肌細胞表達水平隨時間遞增，6-12小時出現(xiàn)高峰(分別為正常組的9.64±0.

12、76，19.04±1.28倍，P<0.01)，而18小時則較對照組仍有差異(為正常組8.6±0.92倍)。 2、熱損傷、缺氧10h、缺氧+LPS、去甲基化劑對心肌細胞損傷及Hl 1蛋白基因表達影響 方法： 根據(jù)前一部分心肌細胞實驗結(jié)果，我們選擇缺氧10h作為缺氧實驗組，同時與缺氧+LPS刺激、熱損傷、去甲基化劑對心肌細胞損傷及Hll蛋白基因表達影響進行比較以SD大鼠乳鼠原代培養(yǎng)的心肌細胞，在培養(yǎng)的第5d

13、根據(jù)干預(yù)條件不同分為5個組：對照組、缺氧組、缺氧+LPS組、去甲基化劑組、熱損傷組。心肌細胞于含l0％FBS-DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；去甲基化組為培養(yǎng)第5d予5-Aza以5×10<'-7>mol／L加入培養(yǎng)液中培養(yǎng)1d；熱應(yīng)激組為培養(yǎng)第6d置42℃溫度下孵育2h后收集標(biāo)本；缺氧10h組心肌細胞施行10h缺氧刺激；缺氧+LPS組為缺氧干預(yù)前加入終濃度為30μM的LPS(事先用培養(yǎng)基溶解)，然后即行缺氧10h處理，建立缺氧+LPS損傷模型

14、。通過檢測心肌細胞形態(tài)和搏動率、培養(yǎng)液LDH活性，MTS比色法檢測心肌細胞存活率等，評估心肌細胞損傷程度。流式細胞儀法測定細胞凋亡率。并提取心肌細胞RNA，RT-PCR法檢測心肌細胞Hll蛋白基因mRNA水平。 結(jié)果： 心肌細胞損傷一般性觀察：與正常對照組比較，缺氧、缺氧+LPS組心肌細胞的搏動頻率明顯降低，搏動幅度減弱，節(jié)律紊亂；熱應(yīng)激刺激后心肌細胞搏動頻率加快，幅度增強，但節(jié)律不規(guī)整，而去甲基化劑組則無明顯變化。與正

15、常對照組相比，缺氧組、缺氧+LPS組、熱損傷組上清液LDH明顯升高，均與肌細胞存活率隨時間推移明顯降低，分別為81.8±7.6％，72.2±8.0％.63.6±7.7％，54.1±6.9％和45.3±5.3％，與正常對照組均有顯著性差異。 第三部分H11蛋白基因在缺氧所致心肌細胞損傷中的作用及其機制研究 目的： 通過ASODN轉(zhuǎn)染缺氧心肌細胞，觀察其對心肌細胞生存率及凋亡的影響，檢測各組心肌細胞Hll蛋白

16、基因表達水平及ERK、p38MAPK磷酸化水平、炎性因子NF-KB與TNF-α水平，旨在探討Hll蛋白基因在燒傷／缺氧心肌細胞中的作用。 結(jié)果： 不同ASODN、SODN、ScODN濃度對Hll蛋白基因mRNA表達水平的影響 10、20及30umol／L濃度ASODNl／2+缺氧干預(yù)后Hll蛋白基因mRNA水平明顯下調(diào)，分別為缺氧組的0.56±0.04／0.47±0.04倍、0.26±0.02／0.24±0.03 倍和0

17、.15±O.01／0.13±0.02倍，與缺氧組有顯著差別(P<0.01)。各濃度SODN+ 缺氧組、Sc0DN+缺氧組與單純?nèi)毖踅MHll蛋白基NmRNA水平相當(dāng)，各濃度SODN組Hll蛋白基因mRNA水平與正常組無差別。 ASODN、SODN、ScODN對心肌細胞的影響 討論與結(jié)論： 缺氧培養(yǎng)可使心肌細胞ERK、p38MAPK磷酸化蛋白水平明顯升高。以往研究表明p38MAPK磷酸化水平升高可能促進了心肌細胞的損