CD36基因在小鼠急性肝損傷中的作用及其機制研究.pdf

1、肝臟是人體內(nèi)最大的實體臟器，具有多重生物學功能，在維持穩(wěn)態(tài)和保持新陳代謝平衡的過程中起到了非常關鍵的作用。
　　肝臟是人類重要的免疫器官，當免疫平衡一旦被破壞，就會引發(fā)多種免疫相關的肝臟疾病，包括HBV、 HCV引起的持續(xù)性慢性肝炎、原發(fā)性肝癌以及自身免疫性肝炎(AIH)等。AIH自身免疫反應介導的慢性進行性肝臟損傷過程，機體產(chǎn)生針對肝臟自身抗原的免疫反應，從而破壞肝細胞導致肝臟炎癥壞死，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年增加，嚴重病例可快

2、速進展為肝硬化和肝衰竭。主要治療手段為免疫抑制劑和肝移植，但效果欠佳，潛在的病理生理機制仍不清楚，因此尚無明確有效的治療方案。
　　肝臟對來自體內(nèi)和體外的許多非營養(yǎng)性物質(zhì)如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，具有生物轉(zhuǎn)化作用，通過新陳代謝將它們徹底分解或以原形排出體外。而各種藥物在使用過程中，因藥物本身或/及其代謝產(chǎn)物或由于特殊體質(zhì)對藥物的超敏感性或耐受性降低會導致藥物性肝損傷(DILI)。目前DILI已經(jīng)上升至全球死亡原因的第五

3、位，成為全球不可忽視的公共衛(wèi)生問題。其致病機制涉及代謝蛋白加合物形成、線粒體功能障礙、氧化應激、過氧亞硝酸鹽形成及核DNA斷裂等關鍵過程，目前臨床均使用N-乙酰半胱氨酸解毒，但存在很多局限性而導致病程遷延不愈，發(fā)展為肝纖維化肝硬化等。
　　分化抗原36(CD36)分子是一種廣泛存在于細胞表面的單鏈糖蛋白，屬于B族清道夫受體，可以在多種細胞如巨噬細胞、微血管內(nèi)皮細胞、血小板、脂肪細胞及上皮細胞等表達，作為模式識別受體，CD36參與一

4、系列生理和病理過程，包括免疫、脂肪酸代謝、血管生成、動脈粥樣硬化和吞噬作用等。CD36還與Toll樣受體4和6結(jié)合以促進無菌炎癥。值得注意的是，CD36被證實與α6整合素及CD133共表達于腫瘤干細胞以促進膠質(zhì)母細胞瘤的進展而抑制CD36受體則會降低人類中黑素瘤、口腔癌及乳腺癌的腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究就CD36在急性肝損傷中發(fā)揮的作用及機制進行了初步探討。
　　第一部分CD36基因敲除在保護小鼠Con A誘導的免疫性肝損傷中的作用及其機

5、制研究
　　刀豆蛋白A(Con A)誘導的免疫性肝損傷模型能較好地模擬人類肝臟自身免疫性疾病和病毒性肝炎的發(fā)病機制。通過給小鼠靜脈注射Con A建立肝臟損傷的實驗動物模型，此模型表現(xiàn)為急性肝炎的臨床和病理組織學表現(xiàn)，包括肝臟中白細胞和淋巴細胞浸潤、肝細胞壞死、血清轉(zhuǎn)氨酶升高及炎性細胞因子分泌等?，F(xiàn)如今此模型已被廣泛應用于研究T細胞介導的肝炎致病機制，從而形成了我們目前關于肝損傷過程的認知。
　　目的:雖然目前已有大量關于自身

6、免疫性肝損傷過程的研究，但其確切的細胞和分子機制尚不清楚。越來越多的數(shù)據(jù)表明T細胞的活化在慢性肝臟損傷過程中具有相當重要的作用。本研究旨在探討CD36基因?qū)細胞介導的自身免疫性肝炎的調(diào)控作用，為當前臨床肝炎的防治提供新的方向。
　　方法:為了探討CD36基因在急性免疫性肝損傷中是否發(fā)揮作用及其作用機制，我們建立了刀豆蛋白A(Con A)誘導的野生型(WT)小鼠及CD36基因缺陷(CD36-/-)小鼠急性肝損傷模型。
　　(

7、1)內(nèi)源性CD36對ConA誘導小鼠肝損傷的影響:WT小鼠和CD36-/-轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)尾靜脈按12mg/kg注射ConA誘導肝臟損傷。在8h后收集血清并檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性;分離小鼠肝組織，利用H&E染色方法觀察肝組織病變;并利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記測定實驗(TUNEL)分析肝細胞凋亡情況。
　　(2)內(nèi)源性CD36對ConA誘導小鼠肝內(nèi)T細胞活化的免疫調(diào)控作用:WT小鼠和CD36-/-小

8、鼠經(jīng)尾靜脈注射ConA后，分離小鼠肝內(nèi)單個核細胞(MNCs)，流式細胞術(shù)檢測T細胞、NK細胞、浸潤性巨噬細胞及中性粒細胞數(shù)，分析細胞的活化水平;實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time RT-PCR)分析肝組織中促炎細胞因子（如TNF-α，CXCL10，IL-1α，MCP-1和IL-6等）的表達;酶聯(lián)免疫吸附測定方法(ELISA)檢測血清中細胞因子的表達水平;免疫印跡方法(Western Blot)檢測肝組織中JNK、IKKα/β

9、、ERK及STAT3的磷酸化水平，以及Caspase-3的表達水平。
　　(3)拮抗劑實驗驗證內(nèi)源性CD36在ConA誘導小鼠肝損傷中的作用:WT小鼠經(jīng)尾靜脈注射Con A后，腹腔注射酪氨酸酶抑制劑染料木素(Genistein)，封閉WT小鼠CD36-TLR4-TLR6復合物形成，通過檢測ALT水平、H&E染色組織學分析以及分離WT小鼠肝內(nèi)MNCs分析T細胞、NK細胞、浸潤性巨噬細胞及中性粒細胞浸潤情況驗證內(nèi)源性CD36在ConA

10、誘導的肝損傷中發(fā)揮的作用。
　　(4)體外實驗分析CD36對CXCL10誘導肝細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用
　　分離WT小鼠和CD36-/-小鼠原代肝細胞，在伴有或者不伴有5μMgenistein刺激的同時，給予100ng/ml ConA分別刺激5min、20min、1h、4h及8h后收集細胞，檢測8h細胞上清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)表達水平;免疫印跡檢測不同時間點刺激后Akt、JNK、IKKα/β及Caspase-3表達水平。
　

11、　結(jié)果:ConA刺激后，WT小鼠較CD36-/-小鼠表現(xiàn)出更為嚴重的肝損傷，ALT水平較高，壞死或凋亡的細胞更多;WT小鼠表達更高水平的炎性細胞因子TNF-α，CXCL10，IL-1α，MCP-1及IL-6;同時，WT小鼠肝組織中總MNCs、CD4+、CD8+T細胞、NK細胞、浸潤的巨噬細胞及中性粒細胞數(shù)均高于CD36-/-小鼠;WT小鼠肝組織中JNK及IKKα/β的磷酸化水平，以及Caspase-3的表達均高于CD36-/-小鼠。此外

12、，實驗表明CD36可以通過Akt、JNK及IKKα/β的磷酸化，以及Caspase-3的激活從而調(diào)節(jié)CXCL10誘導的肝細胞凋亡過程。最后，WT小鼠尾靜脈注射ConA的同時腹腔注射genistein可以明顯降低ALT水平、肝臟組織壞死以及MNCs的浸潤，并且CXCL10刺激肝原代細胞時，孵育genistein后Akt及JNK的磷酸化水平明顯降低。
　　結(jié)論:實驗結(jié)果表明CD36在ConA誘導的肝損傷中通過促進肝臟炎性反應及調(diào)控CX

13、CL10促細胞凋亡發(fā)揮促進炎癥應答的作用，這為臨床免疫性肝炎的防治提供了新的防治思路。
　　第二部分:CD36基因敲除在保護小鼠APAP誘導的藥物性肝損傷中的作用及其機制研究
　　對乙酰氨基酚(APAP)是解熱鎮(zhèn)痛藥的主要成分，其常見的副作用是引起藥物性肝損傷，甚至急性肝衰竭。APAP引起的藥物性肝損傷在歐美國家尤其嚴重，近年來我國的發(fā)病率也逐漸增加，越來越被重視。
　　APAP所致的肝損傷包括APAP代謝蛋白加合物形

14、成、線粒體功能障礙、氧化應激、過氧亞硝酸鹽形成及核DNA斷裂等關鍵過程。最近的研究表明無菌性炎癥和先天免疫細胞可能在APAP誘導的肝損傷和修復中起重要作用。
　　目的:藥物性肝損傷已經(jīng)成為一個不容忽視的嚴重的公共衛(wèi)生問題，盡管一直一來對APAP誘導的肝損傷的機制研究已達數(shù)十年之久，但是仍然存在很多不足之處，只有對其機制更深入研究，才能對APAP誘導的肝損傷提供更為高效有效的預防治療措施。本研究旨在探討CD36基因是否能夠調(diào)控影響A

15、PAP誘導的肝損傷，為當前臨床藥物性肝炎的防治提供新的方向。
　　方法:為了探討CD36基因在藥物性肝損傷中是否發(fā)揮作用及其作用機制，我們建立了刀對乙酰氨基酚（APAP）誘導的野生型(WT)小鼠及CD36基因缺陷(CD36-/-)小鼠急性肝損傷模型。
　　(1) CD36是否參與了APAP誘導的肝損傷過程:WT小鼠隨機分為兩組，給予APAP(250mg/kg)或等量PBS處理，處理后1h、3h、6h、12h及24h取小鼠肝臟

16、，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)檢測肝臟中CD36 mRNA表達水平;蛋白印跡法(Western blot)檢測肝臟中CD36蛋白表達水平。
　　(2)內(nèi)源性CD36對APAP誘導小鼠肝損傷的影響:WT及CD36-/-小鼠停止喂食16h后腹腔注射APAP(250rmg/kg)，在8h及24h后收集血清并檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性;分離小鼠肝組織，利用H&E染色方法觀察肝組織病變;并利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的d

17、UTP缺口末端標記測定實驗(TUNEL)分析肝細胞凋亡情況。
　　(3)內(nèi)源性CD36對APAP誘導小鼠肝內(nèi)炎癥反應的調(diào)控作用:WT小鼠和CD36-/-小鼠經(jīng)腹腔注射APAP后，分離小鼠肝內(nèi)單個核細胞(MNCs)，流式細胞術(shù)檢測浸潤性巨噬細胞及中性粒細胞數(shù)，分析細胞的活化水平;實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time RT-PCR)分析肝組織中促炎細胞因子（如TNF-α，IL-1β，KC，MCP-1和IL-6等）的表達;酶聯(lián)

18、免疫吸附測定方法(ELISA)檢測血清中細胞因子的表達水平;免疫印跡方法(Western Blot)檢測肝組織中JNK、Caspase-3、APAP的代謝產(chǎn)物N-乙酰基對苯醌亞胺(NAPQI)蛋白加合物和細胞色素P4502E1(CYP2E1)的蛋白表達水平。
　　(4)拮抗劑實驗驗證內(nèi)源性CD36在APAP誘導小鼠肝損傷中的作用:WT小鼠經(jīng)腹腔注射APAP后，腹腔注射酪氨酸酶抑制劑PP1，通過檢測ALT水平;以及原代肝細胞培養(yǎng)后檢

19、測上清液AST水平等實驗驗證內(nèi)源性CD36在ConA誘導的肝損傷中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果: APAP刺激后，WT小鼠較CD36-/-小鼠表現(xiàn)出更為嚴重的肝損傷，ALT水平較高，壞死或凋亡的細胞更多;WT小鼠表達更高水平的炎性細胞因子KC，IL-1β，MCP-1及IL-6;同時，WT小鼠肝組織中浸潤的巨噬細胞及中性粒細胞數(shù)均高于CD36-/-小鼠;此外，WT小鼠腹腔注射APAP的同時腹腔注射PP1可以明顯降低ALT水平，以及WT來源