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文檔簡(jiǎn)介
1、膽汁淤積是膽汁生成或流動(dòng)障礙所致的一組疾病的共同臨床癥狀,它是膽管系統(tǒng)的結(jié)石、炎癥、腫瘤等眾多肝膽系統(tǒng)疾病的重要臨床表現(xiàn)之一。此外近年來(lái)由于腹腔鏡技術(shù)的普及,醫(yī)源性膽道損傷導(dǎo)致的膽汁淤積也有上升的趨勢(shì)。膽汁淤積造成肝損傷的過(guò)程中,膽鹽毒性作用一直是大家關(guān)注的焦點(diǎn)。甘氨鵝脫氧膽酸(GCDC)是膽汁成分中的重要膽鹽之一,具有較強(qiáng)的損傷作用,持續(xù)高濃度的毒性膽鹽在血液和肝中持續(xù)滯留被認(rèn)為是導(dǎo)致肝損傷的主要原因。毒性膽鹽刺激可使肝細(xì)胞損傷、膽管
2、增殖、肝纖維化;如果未能及時(shí)糾正,可逐漸進(jìn)展為膽汁淤積性肝硬化,最終導(dǎo)致肝功能衰竭。盡管近年來(lái)其分子機(jī)制研究取得了一些進(jìn)展,但膽汁淤積引起肝細(xì)胞損傷的具體機(jī)制仍未完全闡明,對(duì)許多無(wú)法手術(shù)的患者,仍缺乏有效的治療手段。因此,從分子水平進(jìn)一步深入探討膽汁淤積引起肝細(xì)胞損傷的機(jī)制,可能為藥物治療提供新的思路。
自噬是細(xì)胞通過(guò)降解其自身的細(xì)胞質(zhì)(器)來(lái)為生物合成提供可循環(huán)利用的原料,借此維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和蛋白代謝平衡的過(guò)程。當(dāng)細(xì)
3、胞處于不利環(huán)境時(shí),它是一種重要的自我保護(hù)機(jī)制,對(duì)維持細(xì)胞存活、避免凋亡有積極的作用。目前自噬在膽汁淤積誘導(dǎo)肝損傷過(guò)程中的作用仍不清楚。本課題擬從三個(gè)方面對(duì)此進(jìn)行研究:1、通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物膽管結(jié)扎模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面觀察膽汁淤積對(duì)肝細(xì)胞的損害作用;2、探討自噬在膽汁淤積性肝損傷中的作用;3、進(jìn)一步研究具體的分子機(jī)制,探討ROS在膽汁淤積誘導(dǎo)肝損傷過(guò)程中的作用及其與自噬的關(guān)系。
第一部分膽汁淤積性肝損傷模型的建立
4、 首先在體外建立甘氨鵝脫氧膽酸(GCDC)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型。應(yīng)用不同劑量的GCDC處理正常肝細(xì)胞系L02不同時(shí)間,觀察不同劑量的GCDC對(duì)L02肝細(xì)胞存活的影響以及藥物和劑量、時(shí)間之間的依賴關(guān)系。結(jié)果證實(shí):甘氨鵝脫氧膽酸(GCDC)能夠在體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡,且隨其濃度增加,肝細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率亦明顯上升;其次通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行膽管結(jié)扎(BDL),模擬體內(nèi)病生理過(guò)程,建立小鼠膽汁淤積模型。通過(guò)檢測(cè)小鼠體內(nèi)血清膽紅素、ALT、AST等各項(xiàng)指標(biāo)
5、,觀察膽汁淤積模型是否構(gòu)建成功。結(jié)果提示,雙重結(jié)扎小鼠膽管后血清膽紅素及ALT、AST等各項(xiàng)指標(biāo)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均有顯著升高,提示膽汁淤積模型建立成功。
第二部分自噬在膽汁淤積誘導(dǎo)肝損傷中的作用
以GCDC(200μM)處理L02細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染了GFP-LC3質(zhì)粒的細(xì)胞中GFP-LC3點(diǎn)的聚集,并以透射電鏡觀察自噬小體的聚集情況;通過(guò)WesternBlotting在蛋白水平檢測(cè)LC3的表達(dá),從多方
6、面檢測(cè)GCDC是否影響肝細(xì)胞自噬的發(fā)生。同時(shí)為了進(jìn)一步明確自噬是否影響膽汁淤積造成的肝細(xì)胞損傷,使用自噬抑制劑氯喹(CQ)或自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin)作用于肝細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)自噬被抑制或促進(jìn)前后細(xì)胞凋亡的變化,從而探討自噬在膽汁淤積誘導(dǎo)肝損傷中的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面,使用CQ或Rapamycin作用于BDL模型小鼠,TUNEL檢測(cè)抑制或誘導(dǎo)自噬后小鼠肝細(xì)胞凋亡的變化;對(duì)肝組織進(jìn)行病理分析,比較各實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞壞死程度。
7、結(jié)果顯示:GCDC處理L02細(xì)胞后可在熒光顯微鏡下觀察到大量點(diǎn)狀綠色熒光分布,說(shuō)明GCDC可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,電鏡檢測(cè)和Western Blotting進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果;隨后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CQ抑制自噬后肝細(xì)胞凋亡增加,Rapamycin促進(jìn)自噬后細(xì)胞凋亡減少,而壞死無(wú)明顯變化,提示自噬可能通過(guò)抑制GCDC誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡保護(hù)肝細(xì)胞。另外在BDL小鼠中,CQ抑制自噬后TUNEL顯示肝細(xì)胞凋亡明顯增加,HE顯示肝組織的損傷明顯加
8、重;Rapamycin組結(jié)果則相反,也提示在體內(nèi)自噬可能是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)BDL模型中肝細(xì)胞的生存。
第三部分自噬通過(guò)清除ROS保護(hù)膽汁淤積誘導(dǎo)的肝損傷
為探討ROS在膽汁淤積誘導(dǎo)肝損傷中的作用及其與自噬的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)步驟。首先檢測(cè)GCDC作用下ROS的活性,發(fā)現(xiàn)GCDC能夠誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,而抗氧化劑NAC能夠抑制ROS的累積。隨后為了探討ROS和自噬之間的關(guān)系,使用WesternBlott
9、ing檢測(cè)GCDC誘導(dǎo)自噬過(guò)程中,NAC作用前后LC3的變化。結(jié)果顯示,NAC能使GCDC誘導(dǎo)的LC3表達(dá)部分下調(diào),說(shuō)明ROS含量的變化與自噬的發(fā)生相關(guān)。
動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中選用細(xì)胞DNA氧化損傷的標(biāo)志8-OHdG作為間接檢測(cè)ROS含量的指標(biāo),結(jié)果顯示BDL組中8-OhdG含量低于CQ+BDL組,而Rapamycin組結(jié)果相反,也說(shuō)明抑制自噬后ROS含量增多,提示ROS可能參與了BDL誘導(dǎo)的自噬。最后,我們研究了自噬對(duì)GCDC
10、誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)過(guò)程中ROS的作用。結(jié)果提示CQ抑制自噬后ROS的含量增多,MTT檢測(cè)證實(shí)NAC作用后CQ組細(xì)胞生存率明顯上升,提示GCDC誘導(dǎo)的自噬可能通過(guò)降低ROS的含量從而保護(hù)細(xì)胞存活。綜上,我們的研究結(jié)果提示:
1.膽汁淤積能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生自噬,自噬能夠促進(jìn)受損肝細(xì)胞的存活,減少肝細(xì)胞的凋亡;自噬被抑制后其對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用明顯降低。
2.ROS參與了GCDC誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,自噬可能通過(guò)降低ROS
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