自噬在腎小球足細(xì)胞損傷中的作用機制研究.pdf

1、摘要1:
　　目的：借助足細(xì)胞，觀察Angll及小分子干擾RNA(siRNA)沉默TRPC6后對足細(xì)胞凋亡率和自噬的影響，以探討其分子機制。
　　方法：①設(shè)計、合成實驗組和對照組小分子干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，使TRPC6基因沉默，采用流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測不同濃度siRNA轉(zhuǎn)染后TRPC6基因表達(dá)，優(yōu)化獲得TRPC6基因沉默最佳效果的條件。②體外培養(yǎng)小鼠腎小球足細(xì)胞，設(shè)立對照

2、組，Angll刺激組，TRPC6基因沉默組和3-MA組。對照組用含0.02％DMSO的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；Angll刺激組加入Angll（10-8M）刺激MPC5；TRPC6基因沉默組運用基因沉默技術(shù)沉默TRPC6；3-MA組加入3-MA（2mM），處理后12h，24h和48h觀察細(xì)胞形態(tài)并攝相。采用流氏細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞凋亡率，RT-PCR、Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，激光共聚焦電子顯微鏡觀察自噬相關(guān)蛋白的分

3、布。
　　結(jié)果：①siRNA轉(zhuǎn)染后TRPC6基因mRNA和蛋白的表達(dá)，30nM的TRPC6-siRNA轉(zhuǎn)染24h后TRPC6 mRNA表達(dá)量最低。②Angll組足細(xì)胞凋亡率明顯升高，沉默TRPC6使足細(xì)胞凋亡率明顯降低，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。③透射電鏡下Angll組示足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，自噬表達(dá)增加，胞質(zhì)中出現(xiàn)獨立雙層膜結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)成分及溶酶體等細(xì)胞器形成雙層及多層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。沉默TRPC6使自噬表達(dá)下降

4、，與Angll組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。④Angll組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)增加，沉默TRPC6和自噬特異性阻斷劑3-MA使LC3-Ⅱ表達(dá)下降，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)。⑤激光共聚焦檢測Angll組LC3-Ⅱ的表達(dá)增加，沉默TRPC6使LC3-Ⅱ表達(dá)趨于穩(wěn)定，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)。
　　結(jié)論：Angll促進(jìn)足細(xì)胞的凋亡，沉默TPRC6抑制凋亡；沉默TRPC6和自噬特異性抑制劑3-M

5、A使自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)下調(diào)，達(dá)到保護(hù)自噬，發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞的作用。認(rèn)為沉默TPRC6在Angll誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬與凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　摘要2:
　　目的：本研究旨在觀察腎臟自噬相關(guān)基因 LC3-Ⅱ在阿霉素腎病大鼠模型中不同病理時期的表達(dá)及定位分布的變化情況，研究其與腎小球足細(xì)胞病變過程的相互作用，探討自噬在蛋白尿發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。
　　方法：阿霉素大鼠腎病模型的建立，正常30只大鼠為對照組和30

6、只阿霉素腎病大鼠為模型組。觀察各組在2、4、6、8和10周各項指標(biāo)的變化：①血肌酐、血膽固醇、血漿白蛋白、24h尿蛋白定量和血尿素氮；②各時間點熒光顯微鏡觀察腎臟自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ定位分布的變化；③兩組大鼠進(jìn)行HE、PAS、Masson染色行病理學(xué)檢測。④各時間點透射電子顯微鏡檢測腎臟自噬體的表達(dá)與變化。
　　結(jié)果：①模型組出現(xiàn)高脂血癥和大量蛋白尿，肌酐(Scr)及尿素氮（BUN）水平均比對照組顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.

7、05）。結(jié)果顯示阿霉素腎病大鼠病理表現(xiàn)為腎病綜合征，并最終發(fā)展為腎功能衰竭。②透射電子顯微鏡下模型組足細(xì)胞在病變早期出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生，線粒體腫脹，足突增寬及融合；晚期觀察到足突消失及核固縮。③HE、PAS和Masson染色，2周時系膜增生，4周系膜細(xì)胞發(fā)生空泡變性；6周發(fā)現(xiàn)FSGS的形成；8周80%腎小球內(nèi)見玻璃樣變，腎小管萎縮。④透射電鏡及免疫熒光顯微鏡下，正常組大鼠腎組織自噬表達(dá)量較低，模型組自噬的表達(dá)量異常，在第2周及第10周自噬