糖皮質(zhì)激素保護(hù)腎小球足細(xì)胞損傷及促進(jìn)其損傷后修復(fù)機(jī)制.pdf

1、研究背景:足細(xì)胞是局灶節(jié)段腎小球硬化(FSGS)腎組織病變形成的主要受損靶細(xì)胞。研究表明，足細(xì)胞受到損傷后，發(fā)生凋亡、自噬、壞死，導(dǎo)致其數(shù)目減少。腎小球內(nèi)足細(xì)胞數(shù)目減少直接導(dǎo)致了蛋白尿的發(fā)生和腎小球硬化形成，最終影響腎功能。近年來，隨著腎小球壁層上皮progenitor細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，在腎小球足細(xì)胞損傷修復(fù)研究領(lǐng)域，足細(xì)胞再生修復(fù)機(jī)制引起人們重視。足細(xì)胞損傷后，是否發(fā)生壁層上皮細(xì)胞向足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，增生修復(fù)脫落的足細(xì)胞，防止腎小球硬化發(fā)生，是

2、腎小球再生修復(fù)研究的重點(diǎn)。
　　 糖皮質(zhì)激素類藥物被廣泛用于治療由足細(xì)胞病變導(dǎo)致的腎病綜合征，例如FSGS。然而，該領(lǐng)域尚缺乏糖皮質(zhì)激素類藥物是否可直接作用于腎小球固有細(xì)胞，促進(jìn)足細(xì)胞損傷再生修復(fù)的機(jī)制研究。
　　 因此，本課題的總研究目的將探討糖皮質(zhì)激素對足細(xì)胞的直接保護(hù)作用，以及是否具有促進(jìn)其再生修復(fù)作用。研究將證實(shí)，該作用是否與壁層上皮progenitor細(xì)胞向足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)。
　　 本研究由兩部分組成:

3、
　　 第一部分:體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)觀察糖皮質(zhì)激素治療FSGS模型小鼠對其足細(xì)胞保護(hù)和損傷后修復(fù)的作用。
　　 目的:通過體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，糖皮質(zhì)激素是否具有足細(xì)胞保護(hù)作用，以及糖皮質(zhì)激素是否能促進(jìn)腎小球足細(xì)胞再生，而該過程與增加腎小球壁層上皮progenitor細(xì)胞有關(guān)。
　　 方法:
　　 1.通過具有足細(xì)胞毒性的抗腎小球足細(xì)胞抗體誘導(dǎo)B6129SV/j小鼠建立臨床表現(xiàn)為蛋白尿，腎臟病理表現(xiàn)為局灶節(jié)段性腎小

4、球硬化的小鼠動(dòng)物模型。
　　 2.在模型建立后第3天，經(jīng)皮下注射糖皮質(zhì)激素，分別與治療2周、4周后行活檢，獲取腎組織。
　　 3.重點(diǎn)通過免疫組織化學(xué)染色方法，觀察腎小球病理形態(tài)學(xué)變化，足細(xì)胞數(shù)目增減情況，以及腎臟固有細(xì)胞凋亡和腎小球壁層上皮細(xì)胞分化情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.連續(xù)兩天抗體注射誘導(dǎo)后，腎小球足細(xì)胞與模型第3天已出現(xiàn)明顯下降，糖皮質(zhì)激素治療2周和4周后，足細(xì)胞數(shù)目得到部分恢復(fù)，腎小球硬化

5、程度減輕，而對照組無此現(xiàn)象。
　　 2.糖皮質(zhì)激素治療腎小球足細(xì)胞caspase-3表達(dá)明顯下降，首次于體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素具有抗足細(xì)胞凋亡作用。
　　 3.糖皮質(zhì)激素治療組腎臟足細(xì)胞的progenitor細(xì)胞，定義為同時(shí)表達(dá)足細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞特有蛋白，其數(shù)目明顯多于對照組;并同時(shí)觀察到糖皮質(zhì)激素治療組壁層上皮細(xì)胞出現(xiàn)ERK信號通路磷酸化活躍。
　　 4.糖皮質(zhì)激素治療組模型動(dòng)物，腎小球內(nèi)壁層上皮細(xì)胞表達(dá)CD

6、44明顯降低，而此現(xiàn)象與腎小球硬化程度成正相關(guān)，提示糖皮質(zhì)激素可能通過抑制CD44表達(dá)，而抑制壁層上皮細(xì)胞活化，從而減輕上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，參與硬化病變的形成。
　　 結(jié)論:以足細(xì)胞損傷為特征的FSGS模型小鼠動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，糖皮質(zhì)激素能夠緩解足細(xì)胞損傷，促進(jìn)其再生修復(fù)。此過程可能與糖皮質(zhì)激素抗足細(xì)胞凋亡，通過促進(jìn)腎小球壁層上皮細(xì)胞ERK信號通路活化，向足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，參與其再生修復(fù)過程有關(guān)。
　　 第二部分:體外細(xì)

7、胞培養(yǎng)試驗(yàn)觀察糖皮質(zhì)激素促進(jìn)腎小球壁層上皮細(xì)胞表達(dá)足細(xì)胞蛋白檢測。
　　 目的:通過體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，觀察糖皮質(zhì)激素是否可誘導(dǎo)腎小球壁層上皮細(xì)胞表達(dá)足細(xì)胞特有蛋白。
　　 方法:
　　 1.通過細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，建立小鼠腎臟壁層上皮細(xì)胞系。
　　 2.37℃培養(yǎng)箱中，2％FBS細(xì)胞培養(yǎng)液培育細(xì)胞14天后，加入不同濃度的(1-20μM)地塞米松，繼續(xù)培育24-72小時(shí)。
　　 3.收獲細(xì)胞后，行免疫細(xì)胞

8、化學(xué)染色，觀察成熟壁層上皮細(xì)胞蛋白PAX2和成熟足細(xì)胞蛋白synaptopodin表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同濃度和不同培育時(shí)間的含地塞米松細(xì)胞培養(yǎng)液均能促使壁層上皮細(xì)胞表達(dá)足細(xì)胞特有蛋白synaptopodin，而對照組無此現(xiàn)象。
　　 2.低濃度地塞米松(5μM)促使synaptopodin表達(dá)作用明顯，且該現(xiàn)象可發(fā)生于24小時(shí)內(nèi)。
　　 結(jié)論:
　　 體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激