人殺菌-通透性增加蛋白生物活性片段基因的克隆及其在真核細(xì)胞中的表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、該研究從人外周血PMN中提取細(xì)胞總RNA;采用RT-PCR方法擴(kuò)增BPI N端基因片段,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析;經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化后克隆入pUC19載體;序列分 析表明:所克隆的基因包括信號(hào)肽在內(nèi)的BPI活性片段編碼序列,長(zhǎng)度為726 bp編碼BPI N端前205個(gè)氨基酸;與文獻(xiàn)報(bào)道的序列相比,有6個(gè)核苷酸差異,推導(dǎo)有4個(gè)氨基酸變化,揭示 中國(guó)人BPI N端基因可能存在特殊性;基因內(nèi)無(wú)終止碼,為開放讀框,含有維持BPI

2、結(jié)構(gòu)與功能所必須的3個(gè)半胱氨酸,符合人BPI基因的特征.將重組質(zhì)粒pUC-BPI中的目的基因克隆入 質(zhì)粒pcDNA3構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-BPI,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物在SDS-PAGE中可顯示一條相對(duì)分子質(zhì)量約為25kDa的外源蛋白帶,與預(yù)期的BPI蛋白片段的大小基本一致,Western blot證實(shí),該蛋白帶即為重組表達(dá)的BPI.BPI基因的克隆及真核表達(dá)取得成功,為獲取大量的BPI重組蛋白,深入研

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