殺菌通透性增強(qiáng)蛋白BPI23和人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子haFGF融合基因的酵母表達(dá)及其活性研究.pdf

1、殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白（bacteriacidal/permeability-increasing protein,BPI）是一種分子量為55 KD的陽(yáng)離子蛋白（簡(jiǎn)稱BPI55），具有抑制和殺傷G - 菌，結(jié)合、中和內(nèi)毒素，促進(jìn)補(bǔ)體活化，增強(qiáng)調(diào)理吞噬，抑制炎癥介質(zhì)生成等功能。重組人BPI N端前199個(gè)氨基酸（分子量為23KD的蛋白片段，簡(jiǎn)稱BPI23）保留了完整人天然BPI（nBPI55）的全部生物活性。BPI23分子量較小易于光滑型L

2、PS結(jié)合，對(duì)光滑型大腸桿菌的活性約是完整BPI的30倍。人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（human acidic Fibroblast Growth Factor ,haFGF）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員之一，能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞分化、增殖，具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)損傷修復(fù)、誘導(dǎo)缺血區(qū)血管形成、促進(jìn)傷口愈合等功能。創(chuàng)傷愈合是個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，在臨床治療過(guò)程中仍存在不少障礙，容易受到細(xì)菌等感染，引起菌血癥或膿毒血癥，產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS

3、），繼之形成多臟器功能障礙綜合癥（MODS）。將BPI功能性N端BPI23基因和haFGF基因通過(guò)非極性疏水柔性肽段（Gly4Ser）3的Linker拼接成BPI23-haFGF融合基因，然后克隆到巴氏畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌型表達(dá)載體pPICZαA進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行生物活性研究，為能開(kāi)發(fā)出一種既能縮短創(chuàng)傷愈合時(shí)間、提高愈合質(zhì)量又能避免細(xì)菌感染的雙功能新型多肽類藥物打下基礎(chǔ)。 研究方法與結(jié)

4、果： ①借助Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)2條特異引物，以用Gene SOEing(Gene splicing by overlap extension)技術(shù)拼接的帶信號(hào)肽的BPI23-haFGF融合基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增獲得到約1.1 kb DNA片斷，克隆至pUCm–T載體序列測(cè)定，序列包括編碼無(wú)信號(hào)肽BPI N端前199個(gè)氨基酸基因、編碼（Gly4Ser）3 的Linker基因和不含終止子的 haFGF基因，大小

5、為1107 bp。BLAST結(jié)果表明：融合基因前段與Genebank上的BPI mRNA序列（登錄號(hào)：4502446) 同源性為99％，融合基因后段與Genebank上的haFGF mRNA序列（登錄號(hào)：15055546)完全一致。 ②擴(kuò)增pUCm -BPI23-haFGF質(zhì)粒，用Kpn I / Not I切下BPI23-haFGF基因片斷，并定點(diǎn)克隆至經(jīng)相同雙酶切的真核表達(dá)載體pPICZαA中，構(gòu)建pPICZαA-BPI23

6、-haFGF分泌表達(dá)載體，測(cè)序分析，獲得編碼正確的重組表達(dá)載體pPICZαA-BPI23-haFGF。生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)編碼融合蛋白序列，396個(gè)氨基酸，分子量43.5 KD，pI 為9.24，具有BPI23和haFGF兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，且BPI23保守區(qū)序列99％同源，haFGF保守區(qū)序列100 ％同源。 ③將SacⅠ線性化的pPICZαA-BPI23-haFGF電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母宿主菌X-33中，Zeocin抗性篩選、PC

7、R鑒定后獲得穩(wěn)定工菌株X-33/pPICZαA-BPI23-haFGF；0.5％甲醇誘導(dǎo)工程菌表達(dá)，濃縮上清經(jīng)15％分離膠SDS-PAGE分析和6×His標(biāo)簽一抗Western Blot鑒定，在約43.5 KD有特異性條帶，與目的融合蛋白預(yù)測(cè)大小相符，表達(dá)量為10～20 μg /ml。 ④優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，探索不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同溫度、不同甲醇濃度和不同pH進(jìn)行對(duì)表達(dá)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：28℃、pH5.0、甲醇終濃度為1.0％、

8、PMSF終濃度為0.5 mM、誘導(dǎo)4d為最佳表達(dá)條件，表達(dá)量可達(dá)約25 μg /ml。經(jīng)HisTrap? HP親和層析純化后，融合蛋白純度高達(dá)90％，回收率約為50％。 ⑤生物功能評(píng)價(jià)： 1.體外實(shí)驗(yàn)：瓊脂孔擴(kuò)散法表明，融合蛋白具有一定的抑制和殺傷革蘭氏陰性菌的能力；MTT摻入法檢測(cè)結(jié)果融合蛋白對(duì)NIH3T3細(xì)胞有促增殖活性，當(dāng)融合蛋白濃度為0.40mg/ml時(shí)，促NIH3T3細(xì)胞增殖作用最明顯，當(dāng)濃度高于或低于0.4

9、0mg/ml時(shí)促增殖效果降低。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：造小鼠皮膚淺二度燙傷模型，隔日涂藥，以aFGF標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，以0.9％生理鹽水為陰性對(duì)照，分別在燙傷后7d、14d、21d 取小鼠受損皮膚作病理切片。結(jié)果顯示，燙傷后第14d樣品組創(chuàng)面已基本愈合，潰瘍處毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞遠(yuǎn)比陰性對(duì)照組密集，與aFGF標(biāo)準(zhǔn)品作用相當(dāng)；樣品組比陰性對(duì)照組提前2d～3d 愈合。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了分泌型酵母重組表達(dá)載體pPIC