2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分 SUMO-rhFGF19融合蛋白在Ni親和層析柱上的同步復(fù)性與純化,及其活性檢測
  目的:重組人成纖維細(xì)胞生長因子19(rhFGF19)能調(diào)控糖脂代謝和膽汁酸代謝,具有重要的潛在臨床應(yīng)用價值。然而,以大腸桿菌為載體實現(xiàn)高水平表達(dá)時,rhFGF19以無生物活性的包涵體形式存在,需要經(jīng)過繁瑣且耗時的液相透析復(fù)性才能得到活性蛋白。本研究擬表達(dá)SUMO-rhFGF19并利用融合蛋白中SUMO標(biāo)簽與Ni親和層析柱特異性親和的特性

2、,開展融合蛋白固相復(fù)性。復(fù)性成功后用SUMO蛋白酶特異性切除N端SUMO標(biāo)簽從而獲得具有生物活性的rhFGF19。本研究中的固相復(fù)性既為獲得高產(chǎn)量高純度的rhFGF19提供了新方法,也為其他非可溶性表達(dá)蛋白的復(fù)性提供了參考。
  方法:選用BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)染SUMO-rhFGF19融合蛋白質(zhì)粒,培養(yǎng)菌體至OD600約為0.8~1.2,加入1 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時。收集菌體,用裂解緩沖液(25mM Tris-H

3、Cl,pH8.0,10%(V/V)甘油,150 mM NaCl)重懸冰浴破碎,高速離心收集上清和沉淀部分(包涵體蛋白),將包涵體用變性緩沖液(25 mM Tris-HCl,pH8.0,6M脲,50 mMβ-巰基乙醇,150 mM NaCl)室溫溶解2小時,后在4℃,20000 rpm條件下離心30分鐘,除去不溶物。最后選用0.22μm濾膜過濾變性蛋白,稀釋至特定濃度后進(jìn)行柱上復(fù)性。
  研究變性蛋白濃度對復(fù)性效率和生物學(xué)活性的影響

4、:將蛋白稀釋至1/2.5/7.5mg/mL,分別上樣至預(yù)先用10個柱體積(CVs)變性緩沖液A平衡過的Ni親和層析柱中,后用變性緩沖液A以2 mL/min繼續(xù)平衡柱子至5 CVs。接著按照0.1mL/min流速用復(fù)性緩沖液(25 mM Tris-HCl pH8.0,150 mM NaCl,0.5M尿素,1 mM GSSG,5mMGSH)置換變性緩沖液(Buffer B:0~100%; Buffer A:100%~0),柱上復(fù)性12h。復(fù)

5、性結(jié)束后以1.0 mL/min流速,用平衡緩沖液(25 mM Tris-HCl pH8.0,150 mM NaCl)和洗脫緩沖液(25 mM Tris-HCl pH8.0,150 mM NaCl,1 M imidazole)梯度(Buffer D:0~100%; Buffer C:100%~0)洗脫約10 CVs。
  研究復(fù)性時間對復(fù)性效率和生物學(xué)活性的影響:將蛋白稀釋至1 mg/mL,分別注射至預(yù)先用10個柱體積(CVs)變性

6、緩沖液A平衡過的Ni親和層析柱中,后用變性緩沖液A以2 mL/min,繼續(xù)平衡柱子5CVs。接著按照0.1 mL/min流速用復(fù)性緩沖液B置換變性緩沖液A(Buffer B:0~100%; Buffer A:100%~0),分別柱上復(fù)性4/8/12 h,并按上述方法進(jìn)行洗脫。
  1 mg/mL的復(fù)性蛋白與SUMO蛋白酶以1∶10比例混合孵育,4℃酶切16h。酶切蛋白混合液用Ni親和層析柱純化,SUMO,SUMO-rhFGF19以

7、及SUMO蛋白酶會與Ni親和層析柱結(jié)合,酶切獲得的rhFGF19則在柱子流穿液中。選用rhFGF19單克隆抗體檢驗所獲目標(biāo)蛋白。
  體外生物學(xué)活性檢測,選用HepG2細(xì)胞給藥rhFGF190/0.4/2/10μg/mL刺激30分鐘,Western blotting檢測p-ERK1/2變化情況。體內(nèi)生物學(xué)活性檢測,選用野生型C57BL/6小鼠尾靜脈注射0/10/100μg rhFGF19,給藥兩小時后取肝臟組織,用Trizol法提

8、取總RNA,后Sybrgreen熒光標(biāo)記的RT-PCR測定Cyp7α1表達(dá)量。
  結(jié)果:SUMO-rhFGF19融合蛋白實現(xiàn)了高水平表達(dá),但結(jié)果表明融合蛋白仍以包涵體形式存在。選用Ni親和層析柱成功復(fù)性并純化獲得SUMO-rhFGF19融合蛋白,進(jìn)一步利用SUMO蛋白酶特異性酶切獲得了rhFGF19。體外HepG2細(xì)胞實驗證明,所獲得rhFGF19能有效激活細(xì)胞ERK1/2通路,增加p-ERK1/2水平。小鼠體內(nèi)給藥rhFGF1

9、9能有效抑制肝Cyp7α1 mRNA水平,并呈現(xiàn)劑量依賴性。體內(nèi)活性檢測結(jié)果證明本法所獲得的rhFGF19具有生物學(xué)活性。
  結(jié)論:本研究提出了利用Ni親和層析柱進(jìn)行SUMO-rhFGF19融合蛋白復(fù)性和純化的新工藝。Westem blotting檢測和細(xì)胞實驗分析證實該方法成功一步實現(xiàn)了蛋白的復(fù)性與純化。研究也證實變性蛋白濃度對利用Ni親和層析柱進(jìn)行柱上復(fù)性影響極小,而脲濃度梯度改變較緩復(fù)性時間較長則更能促進(jìn)蛋白復(fù)性。

10、  第二部分 SUMO-rhFGF20融合蛋白的表達(dá),純化及活性測定研究
  目的:重組人成纖維細(xì)胞生長因子20(rhFGF20)可以抑制多巴胺能神經(jīng)元的凋亡,具有對帕金森病等神經(jīng)疾病潛在的治療價值。然而,與rhFGF19一樣,rhFGF20在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá),需要步驟繁瑣且耗時長久的透析復(fù)性才能得到很少的活性蛋白,這大大影響了對其研究的推進(jìn)。本研究擬通過構(gòu)建了SUMO-rhFGF20融合蛋白,來實現(xiàn)FGF20蛋白高效可

11、溶性表達(dá),進(jìn)而大大簡化rhFGF20的蛋白表達(dá)與純化步驟。
  方法:選用BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)染SUMO-rhFGF20融合蛋白質(zhì)粒,20℃培養(yǎng)菌體至OD600約為0.8~1.2,加入1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16小時。收集菌體,用裂解緩沖液(25 mM Tris-HCl,pH8.0,10%(V/V)甘油,150 mM NaCl)重懸冰浴破碎,高速離心收集上清和沉淀部分。用0.22μm濾膜過濾上清可溶性蛋白,用結(jié)合緩沖液A

12、(25 mMTris-HCl,pH8.0,150 mM NaCl,50 mM Imidazole)稀釋5倍過Ni親和層析柱。所得SUMO-rhFGF20蛋白與SUMO蛋白酶以1∶10比例混合孵育,4℃酶切16h。酶切蛋白混合液用Source-Q陰離子交換柱純化。選用rhFGF20單克隆抗體檢驗所獲目標(biāo)蛋白。
  體外生物學(xué)活性檢測:選用NIH3T3細(xì)胞MTT活性實驗,給藥0、25、50、100、200、400 ng/mL。同時NI

13、H3T3細(xì)胞給藥rhFGF200/0.1/0.5/2.5μg/mL刺激30分鐘,Western blotting檢測p-ERK1/2變化情況。
  結(jié)果:SUMO-rhFGF20融合蛋白實現(xiàn)了高效可溶性表達(dá)。選用Ni親和層析柱成功純化獲得SUMO-rhFGF20融合蛋白,進(jìn)一步利用SUMO蛋白酶特異性酶切并純化獲得了rhFGF20。NIH3T3細(xì)胞MTT和Western blotting實驗證明,所獲得rhFGF20能有效激活細(xì)胞

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