成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-18上調(diào)動(dòng)脈壁彈力纖維表達(dá)的體外試驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建攜載人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子－18的慢病毒，并感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和股動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)，研究該因子過(guò)表達(dá)狀態(tài)下，對(duì)這兩種細(xì)胞合成彈力纖維的影響效應(yīng)，為下一步體內(nèi)試驗(yàn)研究FGF-18重建主動(dòng)脈壁彈力纖維的效果初探方向。
　　方法:
　　1.構(gòu)建攜載人FGF-18基因并有flag和GFP標(biāo)簽的慢病毒載體質(zhì)粒，通過(guò)293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，并將包裝后病毒感染293T細(xì)胞，通過(guò)觀察細(xì)胞熒

2、光表達(dá)，和檢測(cè)FGF-18蛋白表達(dá)量，驗(yàn)證該慢病毒包裝效果；
　　2.通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)鑒定FGFR-2在HUVEC和HASMC中的表達(dá)情況；
　　3.以不同MOI值的慢病毒分別感染HUVEC和HASMC，確定兩種細(xì)胞慢病毒感染的最佳MOI值，對(duì)感染效率不佳的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選；
　　4.兩種細(xì)胞各設(shè)立實(shí)驗(yàn)組、空載體對(duì)照組和空白對(duì)照組，通過(guò)real-time PCR、Elisa法及western-blot

3、法檢測(cè)各組細(xì)胞FGF-18、FGF受體-2(FGFR-2)、彈力蛋白原(elastin)、微纖維蛋白-1(fibrillin-1)及fibulin-5在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量，通過(guò)激光共聚焦顯像技術(shù)觀察各組彈力纖維含量的差異，最終采用MTT法評(píng)價(jià)各組細(xì)胞增殖狀態(tài)的差異。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建攜載人FGF-18基因的慢病毒載體質(zhì)粒，經(jīng)293T細(xì)胞包裝后所得慢病毒滴度為3.45×108IU

4、/ml；
　　2.Lentivirus-FGF-18感染293T細(xì)胞后，觀察到明顯的熒光表達(dá)，且MOI=10時(shí)檢測(cè)到FGF-18蛋白高表達(dá)；
　　3.HUVEC的細(xì)胞膜和胞核上可見(jiàn)FGFR-2的陽(yáng)性染色，HASMC在細(xì)胞膜上可觀察到FGFR-2的陽(yáng)性染色；
　　4.HUVECM最佳MOI值為20，而HASMC以MOI=160感染時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與空載體對(duì)照組熒光表達(dá)率均低于30％，經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選后，兩組熒光表達(dá)率均達(dá)90％

5、以上；
　　5.經(jīng)real-time PCR檢測(cè)，HUVEC實(shí)驗(yàn)組中FGF-18、FGFR-2、elastin的mRNA較其他兩組有明顯增高(P<0.05)，fibulin-5和fibrillin-1的mRNA三組間無(wú)明顯差異(P>0.05)；HASMC實(shí)驗(yàn)組中僅FGF-18和FGFR-2的mRNA較其他兩組有明顯增高(P<0.05)，而elastin和fibrillin-1的mRNA三組間無(wú)明顯差異(P>0.05)；
　　

6、6.經(jīng)Elisa法檢測(cè)，HUVEC實(shí)驗(yàn)組FGF-18表達(dá)量較其他兩組高，而HASMC實(shí)驗(yàn)組未發(fā)現(xiàn)FGF-18高表達(dá)；
　　7.經(jīng)western-blot檢測(cè)，HUVEC實(shí)驗(yàn)組的fibulin-5較其他兩組有高表達(dá)趨勢(shì)，三組間elastin無(wú)明顯表達(dá)量差異；HASMC實(shí)驗(yàn)組elastin和fibulin-5的表達(dá)量較其他兩組反而減少；
　　8.通過(guò)激光共聚焦顯像技術(shù)觀察到，HUVEC實(shí)驗(yàn)組中彈力纖維的熒光染色量較空載體對(duì)照組有

7、明顯提高，而HASMC的實(shí)驗(yàn)組未有明顯陽(yáng)性結(jié)果；
　　9.MTT法檢測(cè)到HUVEC和HASMC實(shí)驗(yàn)組的OD值較空載體對(duì)照組均明顯增高(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)能夠成功完成lentivirus-FGF-18的包裝；
　　2.HUVEC和HASMC至少在細(xì)胞膜表面存在FGFR-2：
　　3.lentivirus-FGF-18感染HUVEC和HASMC后，兩種細(xì)胞的FGF-18在m